EPs® 7630 при ураженні епітелію верхніх дихальних шляхів людини: стимуляція механізмів відновлення тканин і модифікація експресії білків щільних контактів

Вступ

Підтримання цілісності епітелію дихальних шляхів та його швидке відновлення є ключовими чинниками захисту від вірусних і бактеріальних інфекцій респіраторного тракту. Інгальовані частинки або мікроорганізми здатні порушувати структуру епітелію, а його неповне відновлення призводить до стійкої втрати функції [1]. Такі довготривалі зміни структури та функції стінки дихальних шляхів можуть погіршувати їхню здатність захищати організм від подальших інфекцій або ушкоджень [1]. Втрата цілісності епітелію також підвищує ризик інфікування вірусами епітеліальних клітин-попередників і субепітеліальних мезенхімальних клітин [2, 3].

Структура та функція респіраторного епітелію, який є бар’єром між тканинами та вдихуваним повітрям, конт­ролюються складом локального позаклітинного матриксу (ПКМ) та білками щільних міжклітинних контактів (МК) епітеліальних клітин [4]. Склад локального ПКM постійно змінюється внаслідок процесів деградації та синтезу de novo. Ці процеси значною мірою регулюються різними цитокінами та факторами росту (зокрема трансформувальним фактором росту β1 (TGF-β1)); їхня активність, своєю чергою, модулюється риновірусом (РВ) [5]. Важливо, що ПКM містить неактивний TGF-β, який активується під час деградації тканини і таким чином контролює диференціювання клітин, що розташовані в матриксі, без необхідності його синтезу de novo [6].

Зниження щільності МК епітеліальних клітин є характерною ознакою запалення слизових оболонок [6]. При інфікуванні РВ епітеліальні клітини секретують TGF-β1, інтерлейкін (ІЛ)-1β, тимічний стромальний лімфопоетин та основний фактор росту фібробластів, які спричиняють руйнування щільних МК між епітеліальними клітинами, полегшуючи інфікування субепітеліальних шарів клітин [7–9]. Експресія білків щільних МК, таких як E-кадгерин, в епітеліальних клітинах регулюється циклічним аденозинмонофосфатом (цАМФ) [10].

РВ-інфекція є основною причиною кашлю та загострень респіраторної патології у дітей, осіб літнього віку та пацієнтів із хронічними запальними захворюваннями легень [10, 11]. Інфікування РВ індукує перехід респіраторних епітеліальних клітин в мезенхімальні шляхом стимуляції синтезу TGF-β1 і втрати цілісності епітеліального бар’єра [9, 12]. Таким чином, РВ-індуковані зміни складу ПКM здатні спричиняти ремоделювання стінки дихальних шляхів і розвиток запалення. У пацієнтів із бронхіальною астмою РВ-інфекція посилює секрецію TGF-β1, що, своєю чергою, підтримує реплікацію вірусу [3]. Отже, швидке й повне відновлення епітелію дихальних шляхів після перенесеної інфекції є важливою складовою 1-ї лінії захисту організму. Вплив РВ-інфекції на ПКМ, білки щільних МК епітеліальних клітин залишається недостатньо вивченим.

У клінічних дослідженнях EPs^® 7630 зменшував тривалість і тяжкість гострих інфекцій дихальних шляхів у дітей та дорослих [13–18]. Хоча більшість клінічних досліджень проведена при гострому бронхіті, ефективність EPs^® 7630 також продемонстрована при застуді: препарат зменшував вираженість симптомів і прискорював одужання порівняно з плацебо [16, 19]. Крім того, EPs^® 7630 забезпечував достовірно вищу частоту досягнення клінічної відповіді та повної ремісії порівняно з плацебо при гострому риносинуситі, ймовірно, бактеріального походження [20], та демонстрував кращу клінічну та антимікробну результативність порівняно з амоксициліном при гострому бактеріальному риносинуситі [21]. Дані клінічних досліджень свідчать про сприятливий профіль безпеки та хорошу переносимість EPs^® 7630 як у дорослих, так і в дітей [22].

Противірусна активність EPs^® 7630 в умовах in vitro зафіксована проти низки вірусів, здатних спричиняти інфекції дихальних шляхів, — РВ 16-го типу (РВ-16) [23, 24], вірусу грипу А [25, 26], респіраторно-синцитіального вірусу [25] та різних коронавірусів, включаючи високу активність проти SARS-CoV-2 [27]. Крім того, EPs^® 7630 має імуномодулювальні властивості, включаючи модулювання вивільнення цитокінів in vitro [28, 29], зменшення вираженості запалення тканин у дослідженнях in vivo на щурах [30] та зниження рівня назальних хемокінів у клінічному дослідженні бактеріального рино­синуситу [21].

Враховуючи важливу роль підтримання гомеостазу епітелію дихальних шляхів під час відновлення після респіраторних інфекцій, ми досліджували вплив EPs^® 7630 на експресію білків щільних МК епітеліальних клітин, процеси клітинного диференціювання та відновлення бронхіальних епітеліальних клітин людини після ушкодження.

Об’єкт і методи дослідження

Дослідження виконували in vitro з використанням 6 первинних ліній клітин бронхіального епітелію людини, отриманих із незміненої легеневої тканини пацієнтів, яким проводили резекцію легень з приводу злоякісних новоутворень, а також іморталізованої лінії бронхіальних епітеліальних клітин людини NuLi-1. Клітини культивували до досягнення конфлюєнтності, після чого обробляли різними концентраціями досліджуваного препарату.

У дослідженні використовували EPs^® 7630 — стандартизований сухий екстракт коренів Pelargonium sidoides DC (африканської пеларгонії) у співвідношенні рослинна сировина / екстракт 1:8–10, отриманий із застосуванням 11% етанолу як екстрагента. Препарат виготовлений із ретельно стандартизованої рослинної сировини (80% коренів походили з дикорослих рослин, 20% — з культивованих плантацій Південної Африки) та охарактеризований відповідно до міжнародного консенсусу ConPhyMP щодо фітохімічної характеристики рослинних екстрактів. Для підтвердження його хімічного складу використали високоефективну рідинну хроматографію з ультра­фіолетовим детектуванням та мас-спектрометрію високої роздільної здатності, високоефективну тонкошарову хроматографію та ядерний магнітний резонанс.

Для оцінки біологічних ефектів EPs^® 7630 використовували комплекс сучасних методик. Проліферацію клітин визначали методом прямого підрахунку клітин та за допомогою колориметричного тесту з 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію бромідом. Модель вірусного ушкодження створювали шляхом інфікування клітин РВ-16, а ефективність інфікування підтверджували методом імунофлуоресцентної мікроскопії. Внутрішньоклітинний рівень цАМФ визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), а роль окремих сигнальних шляхів досліджували із застосуванням селективних інгібіторів аденілатциклази, позаклітиннорегульованої протеїнкінази та р38-мітогенактивованої протеїнкінази. Активацію сигнальних білків оцінювали методом вестерн-блот-аналізу.

Репаративний потенціал епітелію вивчали за допомогою моделі механічного ушкодження клітинного моношару з подальшим кількісним аналізом загоєння площі ушкодження. Синтез компонентів ПКМ (колагенів I та IV типів, фібронектину) й експресію Е-кадгерину визначали методом клітинного ІФА.

Статистичну обробку результатів проводили із застосуванням однофакторного дисперсійного аналізу або t-критерію Стьюдента. Різницю між групами вважали статистично значущою при p<0,05. Результати наведено як середнє значення ± стандартна похибка середнього.

Результати

EPs^® 7630 регулює проліферацію епітеліальних клітин через сигнальні шляхи cAMP і p38 MAPK

Вплив EPs^® 7630 на епітеліальні клітини досліджували в первинних клітинах шляхом їх прямого підрахунку (рис. 1А, верхня частина) та в клітинах NuLi за допомогою МТТ-тесту (рис. 1А, нижня частина). Обидва методи продемонстрували подібні результати, довівши, що EPs^® 7630 стимулює проліферацію епітеліальних клітин концентраційнозалежним чином (використовували концентрації 0,1–10 мкг/мл) протягом 48 год (рис. 1А). Інфікування РВ-16 (множинність інфікування — МОІ) протягом 48 год достовірно зменшувало кількість клітин, однак цей ефект нівелювався за умов попередньої інкубації з EPs^® 7630 концентраційнозалежним чином (рис. 1А).

Сигнальні шляхи, що регулюють мітогенний ефект EPs^® 7630 в епітеліальних клітинах, вивчали шляхом фармакологічного інгібування cAMP, Erk1/2 і p38 із використанням прямого підрахунку клітин у первинній культурі (рис. 1В, верхня частина) та в клітинах NuLi за допомогою МТТ-тесту (рис. 1В, нижня частина). EPs^® 7630 (10 мкг/мл)-індуковане посилення проліферації епітеліальних клітин достовірно пригнічувалося після попередньої інкубації клітин з дидезоксиаденозином (ДДА) або SB203580, але не з PD98059 (рис. 1В). Крім того, інгібування сигнальних шляхів cAMP або p38 MAPK додатково посилювало негативний вплив РВ-інфекції на кількість клітин (рис. 1В).

EPs^® 7630 у концентрації 10 мкг/мл уже через 5 хв достовірно підвищував внутрішньоклітинний рівень цАМФ, потім концентрація останнього поступово знижувалася (рис. 1С). Через короткочасний характер реакції цАМФ оцінити, чи впливає інфікування РВ-16 на його утворення, не було можливості. Надалі EPs^® 7630 у концентрації 10 мкг/мл індукував фосфорилювання субстрату цАМФ — протеїнкіназу Akt, що досягало максимуму через 15 хв (рис. 1D). Крім того, виявили фосфорилювання білка, що зв’язується з цАМФ-чутливим елементом відповіді білка (cAMP-response element-binding protein — CREB), максимальний рівень якого реєстрували через 30 хв (рис. 1Е). EPs^® 7630 також активував фосфорилювання p38 MAPK протягом 60 хв (рис. 1F). У тих самих зразках через 30 хв відзначали фосфорилювання mTOR (рис. 1G). Репрезентативні результати вестерн-блот-аналізу, що демонструють характер фосфорилювання сигнальних білків, наведено на рис. 1H. Натомість експресія JNK-MAPK та STAT3 (компонента сигнального шляху TGF-β) за жодної з досліджуваних умов не змінювалася. Як контроль навантаження при вестерн-блот-аналізі використовували α-тубулін.

Рисунок 1. Стимуляція EPs^® 7630 проліферації епітеліальних клітин та внутрішньоклітинної сигналізації

Примітки: A — EPs^® 7630 збільшує кількість епітеліальних клітин (48 год) та компенсує втрату РВ-інфікованих клітин; *достовірні відмінності порівняно з конт­ролем через 48 год. B — роль сигнальних медіаторів у EPs^® 7630-індукованій проліферації клітин. C — EPs^® 7630 стимулює утворення внутрішньоклітинного цАМФ. D — кінетика EPs^® 7630-залежного переходу Akt у фосфорильовану форму (p-Akt). E — кінетика EPs^® 7630-залежного переходу CREB у форму p-CREB. F — кінетика EPs^® 7630-залежного переходу протеїну-38 (p38) у форму p-p38 MAPK. G — кінетика EPs^® 7630-залежного від mTOR у p-mTOR. H — репрезентативні вестерн-блоти, використані для побудови наведених вище стовпчастих діаграм сигнальних білків. Стовпці відображають середнє значення ± стандартна похибка середнього для експериментів, проведених на 4 різних штамах епітеліальних клітин.

EPs^® 7630 модифікує склад ПКМ епітеліальних клітин

Збільшення кількості клітин, оброблених EPs^® 7630, супроводжувалося посиленим відкладанням фібронектину (рис. 2А). Стимулювальний вплив EPs^® 7630 на відкладання фібронектину мав концентраційнозалежний характер та зберігався у РВ-16-інфікованих клітинах (рис. 2А). Інфікування РВ не впливало на синтез фібронектину (рис. 2А). Попередня інкубація клітин з інгібітором цАМФ (ДДА або SB203580), інгібітором p38 MAPK зменшувала EPs^® 7630-стимульоване відкладання фібронектину (рис. 2В), але не чинила значущого впливу на інгібування Erk1/2 MAPK (рис. 2В).

Експресію колагену I типу визначали в необроблених клітинах; вона знижувалася під впливом EPs^® 7630 (рис. 2С). Інфікування РВ-16, навпаки, посилювало відкладання колагену I типу, однак цей ефект знижувався за умов попередньої обробки клітин EPs^® 7630 (рис. 2С). За даними клітинного ІФА, EPs^® 7630 пригнічував відкладання колагену I типу концентраційнозалежним чином (рис. 2D). Блокування сигнальних шляхів cAMP або Erk1/2 MAPK також нейтралізувало інгібувальний вплив EPs^® 7630 на депонування колагену I типу (рис. 2D).

Рисунок 2. Вплив EPs^® 7630 на експресію фібронектину та колагену І типу

Примітки: A — дані клітинного ІФА щодо EPs^® 7630-індукованого відкладення фібронектину. B — роль клітинної сигналізації у EPs^® 7630-індукованому відкладенні фібронектину. C — інгібувальний вплив EPs^® 7630 на відкладення колагену І типу. D — експресія колагену І типу під впливом різних інгібіторів клітинної сигналізації. Стовпці відображають середнє значення ± стандартна похибка середнього для 4 клітинних ліній.

EPs^® 7630 модифікує експресію білків щільних МК епітеліальних клітин

У первинних епітеліальних клітинах відзначали різний, специфічний для окремих клітинних ліній, характер експресії білків щільних МК, тоді як клітини NuLi експресували всі досліджувані білки. Тому для оцінки впливу EPs^® 7630 на експресію білків щільних МК використовували саме клітини NuLi (рис. 3).

Як показано на рис. 3А, у нативних клітинах протягом 48 год відбувалося підвищення експресії клаудину-1, тоді як у клітинах, оброблених EPs^® 7630, цей процес був менш вираженим. Рівень клаудину-4 спочатку підвищувався (через 24 год), однак через 48 год у клітинах, оброб­лених EPs^® 7630, його експресія знижувалася (рис. 3В). Експресія оклюдину під впливом EPs^® 7630 достовірно не змінювалася (рис. 3С). В необроблених клітинах експресія десмоколіну-2 зростала протягом 48 год, тоді як EPs^® 7630 достовірно пригнічував цей процес (рис. 3D). Експресія десмоглеїну-2 також знижувалася в клітинах, оброблених EPs^® 7630, в обидві контрольні часові точки та набувала статистичної достовірності через 48 год (рис. 3Е). Експресія білка щільних контактів-1 (ZO-1) у клітинах, оброблених EPs^® 7630, була нижчою в обох контрольних точках порівняно з необробленими клітинами, але не досягала статистичної значущості (рис. 3F).

Рисунок 3. Модифікування EPs^® 7630 експресії білків щільних МК з’єднань та диференціації клітин

Примітки: репрезентативні вестерн-блоти та результати аналізу зображень 4 вестерн-блотів представлені у вигляді стовпчастих діаграм із вказанням середніх значень ± стандартна похибка середнього для: A — клаудину-1, B — клаудину-4, C — оклюдину, D — десмоколіну-2, E — десмоглеїну-2, F — білка щільних контактів (ZO)-1. В якості контролю використовували α-тубулін, який був однаковим для всіх 6 білків щільних з’єднань. Статистичний аналіз проводили з використанням t-критерію Стьюдента.

EPs^® 7630 посилює диференціювання епітеліальних клітин і захисні механізми організму хазяїна

Підтверджуючи раніше отримані результати, EPs^® 7630 підвищував експресію E-кадгерину в епітеліальних клітинах концентраційнозалежним чином (рис. 4А). Аналогічно експресія гелзоліну значно зростала під впливом EPs^® 7630 (рис. 4В). Щодо РВ-інфекції та захисту організму хазяїна, EPs^® 7630 концентраційнозалежним чином знижував експресію ICAM-1, одного з основних рецепторів РВ (рис. 4С). Навпаки, експресія β-дефензину-1 достовірно зростала протягом 24 год під впливом EPs^® 7630 (рис. 4D).

Рисунок 4. Модифікування EPs^® 7630 експресії білків щільних з’єднань та диференціації клітин

Примітки: репрезентативні вестерн-блоти та подальший аналіз зображень 4 незалежних експериментів представлені для: A — E-кадгерину, B — гелзоліну, C — ICAM-1, D — β-дефензину-1. В якості контролю використовували α-тубулін, який був однаковим для всіх 5 білків щільних з’єднань. Стовпчасті діаграми відображають середнє значення ± стандартна похибка середнього; значення p розраховували з використанням t-критерію Стьюдента.

EPs^® 7630 покращує репарацію ушкодженого епітелію

Модель ушкодження епітелію створювали шляхом нанесення подряпини на суцільний моношар епітеліальних клітин за допомогою наконечника піпетки об’ємом 10 мкл. Перед цим клітини протягом 30 хв обробляли EPs^® 7630 (5 або 25 мкг/мл у 0,35% етанол-фосфатно-сольовому буферному розчині) або лише розчинником (0,35% етанол-фосфатно-сольовий буферний розчин) за наявності або відсутності РВ-16 (MOI 1). Динаміку загоєння оцінювали методом фазово-контрастної мікроскопії протягом 24 год, визначаючи площу ушкодженої ділянки (рис. 5А).

Як демонструє рис. 5В, у неінфікованих епітеліальних клітинах площа ушкодження зменшувалася на 50% через 8,5 год, тоді як в EPs^® 7630-оброблених клітинах відмічено концентраційнозалежне прискорення загоєння дефекту. За умов попередньої інкубації з EPs^® 7630 у концентрації 5 мкг/мл закриття дефектів на 50% зафіксували вже через 5,3 год, а при використанні концентрації 25 мкг/мл зменшення дефектів на 50% — вже через 4,1 год. Через 24 год усі дефекти, за винятком ушкоджень у РВ-16-інфікованих клітинах, були повністю закриті.

У клітинах, інфікованих РВ-16, протягом перших 6 год після ушкодження закриття ураження майже не відбувалося (рис. 5А), а зменшення дефекту на 50% відзначали лише через 24 год (рис. 5С). За умов попередньої обробки EPs^® 7630 у концентрації 5 мкг/мл зменшення ушкодження на 50% відзначали вже через 5,2 год (рис. 5С). Водночас у клітинах, попередньо оброблених EPs^® 7630 у концентрації 25 мкг/мл, зменшення дефекту на 50% відзначали через 6,5 год (рис. 5С).

Рисунок 5. Вплив EPs^® 7630 на репарацію ушкоджень в первинних епітеліальних клітинах людини

Примітки: A — репрезентативні фазово-контрастні мікрофотографії та вимірювання площі ушкодження (ділянка між двома синіми лініями) протягом 6 год. Аналогічні результати отримані в 2 додаткових клітинних лініях. B — Кінетика репарації ушкодження інтактних клітин протягом 24 год. C — кінетика репарації ушкоджених клітин, інфікованих РВ-16, протягом 24 год. Точки даних відображають середнє значення ± стандартна похибка середнього для 3 клітинних ліній; кожна клітинна лінія та часова точка вимірювалися в 2 незалежних експериментах. Значення p вказують на достовірні відмінності між необробленими клітинами та клітинами, попередньо обробленими EPs^® 7630.

Обговорення

Раніше було показано, що EPs^® 7630 скорочує тривалість і знижує тяжкість гострих вірусних інфекцій дихальних шляхів у пацієнтів із хронічними запальними захворюваннями легень. Цей позитивний ефект EPs^® 7630 пов’язували насамперед із запобіганням прикріпленню вірусів та їх подальшій реплікації в клітинах хазяїна [23, 25, 27]. Результати, отримані в цьому дослідженні, свідчать, що EPs^® 7630 може мати додаткові властивості, впливаючи на функцію епітеліальних клітин хазяїна, покращуючи їх диференціювання та регенерацію; узагальнення отриманих результатів наведено на рис. 6. Перелічені ефекти мають важливе значення у відновленні тканин дихальних шляхів після перенесеної вірусної інфекції [31].

Рисунок 6. Узагальнення EPs^® 7630-індукованої цАМФ-залежної регуляції функції епітеліального бар’єру та зниженої експресії білків щільних з’єднань, що беруть участь у прикріпленні вірусу

Примітки: «P» у колі позначає фосфорилювання відповідного сигнального білка; стрілка ↑ вказує на підвищення регуляції, стрілка ↓ — на зниження регуляції.

Епітелій дихальних шляхів є 1-ю лінією захисту респіраторного тракту та основними «воротами» проникнення вірусних патогенів. Вірусна інфекція знижує цілісність епітеліального шару та змінює склад локального ПКМ, у якому розташовані клітини. Ці зміни можуть бути зумовлені як прямою, так і опосередкованою дією вірусу завдяки індукції запальної відповіді організму-хазяїна. Показано, що РВ-інфекція стимулює ремоделювання тканин і призводить до втрати цілісності епітелію, принаймні у хворих на бронхіальну астму [32, 33]. Руйнування епітеліального бар’єра під впливом РВ полегшує проникнення алергенів і спричиняє розвиток субепітеліального запалення [34]. Крім того, у моделі спільної культури клітин інфікування РВ гладком’язових клітин дихальних шляхів посилювало реплікацію вірусу в епітеліальних клітинах пацієнтів із бронхіальною астмою [35]. Цікаво, що РВ-інфекція стимулює ремоделювання стінки дихальних шляхів шляхом індукції TGF-β1 [5] або представника родини фактора некрозу пухлини (LIGHT) та ІЛ-1β [9]. РВ-індукований епітеліально-мезенхімальний перехід (EMП) залежав від змін складу ПКM [12]. Водночас у цьому дослідженні EPs^® 7630 не впливав на активність сигнального трансдуктора TGF-β- STAT3, але активував сигнальні шляхи Erk1/2 і цАМФ, що узгоджується з даними попередніх досліджень.

Щодо внутрішньоклітинної сигналізації в EPs^® 7630-оброблених епітеліальних та імунних клітинах встановлено, що основними ранніми сигнальними білками є Erk1/2 та p38 MAPK [24, 36]. У нашому дослідженні стимулювальний вплив EPs^® 7630 на проліферацію епітеліальних клітин залежав від активації сигнального шляху цАМФ. Це узгоджується з даними про те, що активація цАМФ форсколіном пригнічує сигнальний шлях TGF-β та посилює диференціювання й проліферацію епітеліальних клітин [37]. У нашому дослідженні EPs^® 7630 вже протягом перших хвилин підвищував внутрішньоклітинний рівень цАМФ, а інгібування цього механізму за допомогою ДДА усувало всі описані вище позитивні зміни щодо функції епітеліальних клітин.

РВ-інфекція призводить до втрати міжклітинної адгезії в епітелії [38, 39]. Порушення щільних МК епітеліальних клітин після інфікування також описане у дітей із бронхіальною астмою [40]. Однак механізми цих змін досі недостатньо вивчені. Результати проведених експериментів свідчать, що EPs^® 7630 може сприяти відновленню окремих МК, які беруть участь у противірусному захисті, це може пояснити швидше відновлення після вірусної інфекції. Наше дослідження вперше продемонструвало, що EPs^® 7630 покращує формування МК між епітеліальними клітинами шляхом підвищення експресії трьох білків міжклітинних контактів-1: клаудину-4, десмоколіну-2 та десмоглеїну-2.

Втрата клаудину-4 при інфікуванні вірусом грипу асоціюється з порушенням бар’єрної функції альвеолярного епітелію людини [41]; аналогічні зміни продемонстровані in vitro при інфікуванні епітеліальних клітин ВІЛ [42]. Десмоколін-2 належить до родини десмосомальних кадгеринів та регулює МК. Інфікування вірусом Коксакі спричиняє деградацію десмоколіну-2, що призводить до ушкодження тканин і запалення кардіоміоцитів [43]. Десмоколін-2 функціонально пов’язаний із фібронектином у процесі забезпечення міжклітинної адгезії та в цьому контексті запобігає анойкісу (апоптозу, індукованому втратою контакту клітин із ПКМ — прим. ред.) [44]. Сам фібронектин є необхідним для підтримання бар’єрної функції епітелію [45]. Точна роль десмоколіну-2 в умовах вірусної інфекції потребує подальшого вивчення. Проте підвищення його експресії під впливом EPs^® 7630 потенційно може покращувати виживання клітин під час вірусної інфекції та прискорювати регенерацію тканин. Десмоглеїн-2 експресується на апікальній поверхні епітеліальних клітин і підтримує їх полярність [46]. Водночас разом з іншими представниками своєї родини десмоглеїн-2 також описаний як білок-докер для вірусів, що спричиняють гострий респіраторний дистрес-синдром [47, 48]. Отже, сумарним наслідком індукції десмоглеїну-2 під впливом EPs^® 7630, імовірно, є посилення диференціювання епітелію, хоча значення цього ефекту при вірусній інфекції потребує подальших досліджень.

Структура та бар’єрна функція епітелію значною мірою визначаються складом ПКM, який зазнає швидкого оновлення — до 10% на добу [49]. Інфікування РВ в ранньому віці змінює склад ПКM шляхом пригнічення ферментів, що забезпечують його деградацію [50]. Це може пояснити підвищення експресії фібронектину, перлекану та колагену IV типу під впливом РВ [5]. Інфікування РВ також посилює ремоделювання клітин гладких м’язів дихальних шляхів і фібробластів [2]. У процесах регенерації та репарації тканин фібронектин стимулює проліферацію епітеліальних клітин і репарацію ушкоджень [51]. Тому виявлене підвищення рівня фібронектину в клітинах, оброблених EPs^® 7630, може сприяти швидшому одужанню, що відзначено в клінічних дослідженнях [13, 52]. Крім того, EPs^® 7630-індукований синтез фібронектину потенційно здатний забезпечити зниження бактеріального інфікування епітеліальних клітин [53].

У цьому дослідженні EPs^® 7630 покращував відновлення епітеліальних клітин після експериментального ушкодження як у контрольних клітинах, так і в клітинах, інфікованих РВ-16. Саме ці ефекти EPs^® 7630 можуть пояснювати скорочення тривалості симптомів у пацієнтів із РВ-інфекцією [13, 14, 16, 19]. Отримані результати додатково підтверджують гіпотезу, що підтримання цілісності МК епітелію та його взаємодії з локальним ПКМ є важливим фактором захисту від вірусної інфекції або зменшення її поширення [54].

Ідентифікація окремих активних компонентів EPs^® 7630 не входила до завдань цього дослідження. Як рослинний екстракт EPs^® 7630 має складний хімічний склад і містить вуглеводи, мінерали, пептиди, похідні пуринів, високозаміщені бензопіранони, а також оліго- та полімерні продельфінідини, що описано раніше [24, 55, 56]. Продельфінідини належать до класу проантоціанідинів, які, як відомо, здатні впливати на епітеліальні МК в різних органах [57, 58]. Проантоціанідини також ідентифіковані як активні компоненти, що зумовлюють антибактеріальні та противірусні властивості EPs^® 7630 [53, 59]. Крім того, антоціани іншого походження запобігали ЕМП альвеолярних епітеліальних клітин та підвищували експресію E-кадгерину, покращуючи таким чином їх диференціювання і формування МК [60]. Хоча літературні дані свідчать про важливу роль поліфенольних компонентів EPs^® 7630, загальний ефект екстракту, зафіксований у нашій експериментальній роботі, вірогідно, є результатом комбінованої дії численних компонентів із різними біологічними властивостями.

До обмежень цього дослідження належить відсутність даних щодо впливу EPs^® 7630 на взаємодію між епітеліальними та мезенхімальними клітинами до і після інфікування РВ. Крім того, складно довести, що окремий компонент ПКМ, зокрема фібронектин, безпосередньо знижує сприйнятливість клітин хазяїна до вірусної або бактеріальної інфекції. Описані вище ефекти EPs^® 7630 потребують підтвердження у пацієнтів із РВ-інфекцією. Водночас слід зазначити, що подібні дослідження неможливо адекватно виконати на тваринних моделях через видові особливості механізмів репарації тканин [61]. Важливо, що склад EPs^® 7630 не дозволяє пов’язати його позитивний вплив на репаративні процеси з якоюсь однією конкретною сполукою. Найімовірніше, сприятливий вплив EPs^® 7630 на репарацію та регенерацію тканин є результатом комбінованої дії природних біологічно активних речовин, що входять до складу екстракту. Оскільки діючою фармацевтичною субстанцією лікарського засобу є цілісний екстракт EPs^® 7630, дослідження окремих його компонентів у межах цієї роботи не проводилося.

Загалом отримані нами результати продемонстрували, що EPs^® 7630 модифікує внутрішньоклітинну сигналізацію, впливає на склад ПКМ та покращує репарацію ушкоджень у клітинах бронхіального епітелію людини. Дані, отримані як у клітинних лініях, так і в первинних культурах клітин бронхіального епітелію, свідчать, що EPs^® 7630 сприяє відновленню тканин після РВ-інфекції, що, ймовірно, є одним із механізмів клінічно підтвердженого прискорення одужання пацієнтів з інфекціями дихальних шляхів.

Що залишилося поза фокусом статті: коментар редакції

У представленій статті використовується особливе позначення діючої речовини, яке може здатися дивним на перший погляд. EPs^® 7630 — це не умовний лабораторний код і не назва окремої діючої речовини. Так позначають стандартизований сухий екстракт коренів Pelargonium sidoides (африканської пеларгонії) з відтворюваним фітохімічним складом; саме він є об’єктом усіх доклінічних та клінічних досліджень цього лікарського засобу.

В Україні оригінальний стандартизований екстракт EPs^® 7630 представлений під торговою назвою Умкалор®. Отже, наведені в роботі дані характеризують механізми дії цього препарату.

Результати дослідження продемонстрували, що EPs^® 7630 не лише має противірусні та імуномодулювальні властивості, а й активує природні механізми відновлення епітелію дихальних шляхів після вірусного ушкодження. Зокрема, EPs^® 7630 стимулював проліферацію та диференціювання епітеліальних клітин, прискорював репарацію епітеліального шару, модулював експресію білків міжклітинних контактів і склад позаклітинного матриксу. Крім того, EPs^® 7630 знижував експресію ICAM-1 (одного з основ­них рецепторів адгезії РВ), а також підвищував експресію β-дефензину-1, важливого компонента вродженого імунного захисту.

Таким чином, окрім добре відомої противірусної активності, EPs^® 7630 здатний сприяти швидшому відновленню структурної цілісності та бар’єрної функції слизової оболонки дихальних шляхів після перенесеної вірусної інфекції, підтримуючи природні процеси регенерації епітелію.

Список використаної літератури

• 1. Akdis C.A. The epithelial barrier hypothesis proposes a comprehensive understanding of the origins of allergic and other chronic noncommunicable diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 2022;149:41–44. doi: 10.1016/j.jaci.2021.11.010.
• 2. Shariff S., Shelfoon C., Holden N.S., Traves S.L., Wiehler S., Kooi C., Proud D., Leigh R. Human Rhinovirus Infection of Epithelial Cells Modulates Airway Smooth Muscle Migration. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017;56:796–803. doi: 10.1165/rcmb.2016-0252OC.
• 3. Jakiela B., Rebane A., Soja J., Bazan-Socha S., Laanesoo A., Plutecka H., Surmiak M., Sanak M., Sladek K., Bochenek G. Remodeling of bronchial epithelium caused by asthmatic inflammation affects its response to rhinovirus infection. Sci. Rep. 2021;11:12821. doi: 10.1038/s41598-021-92252-6.
• 4. Sunil A.A., Skaria T. Novel regulators of airway epithelial barrier function during inflammation: Potential targets for drug repurposing. Expert Opin. Ther. Targets. 2022;26:119–132. doi: 10.1080/14728222.2022.2035720.
• 5. Kuo C., Lim S., King N.J., Bartlett N.W., Walton R.P., Zhu J., Glanville N., Aniscenko J., Johnston S.L., Burgess J.K., et al. Rhinovirus infection induces expression of airway remodelling factors in vitro and in vivo. Respirology. 2011;16:367–377. doi: 10.1111/j.1440-1843.2010.01918.x.
• 6. Samaha E., Vierlinger K., Weinhappel W., Godnic-Cvar J., Nöhammer C., Koczan D., Thiesen H.J., Yanai H., Fraifeld V.E., Ziesche R. Expression Profiling Suggests Loss of Surface Integrity and Failure of Regenerative Repair as Major Driving Forces for Chronic Obstructive Pulmonary Disease Progression. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2021;64:441–452. doi: 10.1165/rcmb.2020-0270OC.
• 7. Tugizov S. Virus-associated disruption of mucosal epithelial tight junctions and its role in viral transmission and spread. Tissue Barriers. 2021;9:1943274. doi: 10.1080/21688370.2021.1943274.
• 8. Atkinson S.K., Sadofsky L.R., Morice A.H. How does rhinovirus cause the common cold cough? BMJ Open Respir. Res. 2016;3:e000118. doi: 10.1136/bmjresp-2015-000118.
• 9. Mehta A.K., Doherty T., Broide D., Croft M. Tumor necrosis factor family member LIGHT acts with IL-1β and TGF-β to promote airway remodeling during rhinovirus infection. Allergy. 2018;73:1415–1424. doi: 10.1111/all.13390.
• 10. Oldenburger A., Poppinga W.J., Kos F., de Bruin H.G., Rijks W.F., Heijink I.H., Timens W., Meurs H., Maarsingh H., Schmidt M. A-kinase anchoring proteins contribute to loss of E-cadherin and bronchial epithelial barrier by cigarette smoke. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2014;306:C585–C597. doi: 10.1152/ajpcell.00183.2013.
• 11. Kerr S.L., Mathew C., Ghildyal R. Rhinovirus and Cell Death. Viruses. 2021;13:629. doi: 10.3390/v13040629.
• 12. Minor D.M., Proud D. Role of human rhinovirus in triggering human airway epithelial-mesenchymal transition. Respir. Res. 2017;18:110. doi: 10.1186/s12931-017-0595-9.
• 13. Seifert G., Brandes-Schramm J., Zimmermann A., Lehmacher W., Kamin W. Faster recovery and reduced paracetamol use—A meta-analysis of EPs 7630 in children with acute respiratory tract infections. BMC Pediatr. 2019;19:119. doi: 10.1186/s12887-019-1473-z.
• 14. Wopker P.M., Schwermer M., Sommer S., Längler A., Fetz K., Ostermann T., Zuzak T.J. Complementary and alternative medicine in the treatment of acute bronchitis in children: A systematic review. Complement. Ther. Med. 2020;49:102217. doi: 10.1016/j.ctim.2019.102217.
• 15. Agbabiaka T.B., Guo R., Ernst E. Pelargonium sidoides for acute bronchitis: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2008;15:378–385. doi: 10.1016/j.phymed.2007.11.023.
• 16. Schapowal A., Dobos G., Cramer H., Ong K.C., Adler M., Zimmermann A., Brandes-Schramm J., Lehmacher W. Treatment of signs and symptoms of the common cold using EPs 7630—Results of a meta-analysis. Heliyon. 2019;5:e02904. doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e02904.
• 17. Matthys H., Lehmacher W., Zimmermann A., Brandes J., Kamin W. EPs 7630 in acute respiratory tract infections—A systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. J. Lung Pulm. Respir. Res. 2016;3:4–15. doi: 10.15406/jlprr.2016.03.00068.
• 18. Brendler T., Al-Harrasi A., Bauer R., Gafner S., Hardy M.L., Heinrich M., Hosseinzadeh H., Izzo A.A., Michaelis M., Nassiri-Asl M., et al. Botanical drugs and supplements affecting the immune response in the time of COVID-19: Implications for research and clinical practice. Phytother. Res. 2021;35:3013–3031. doi: 10.1002/ptr.7008.
• 19. Riley D.S., Lizogub V.G., Heger M., Funk P., Mueller H., Lehmacher W. Treatment with EPs 7630, a Pelargonium sidoides Root Extract, Is Effective and Safe in Patients with the Common Cold: Results From a Randomized, Double Blind, Placebo-Controlled Clinical Trial. Integr. Med. 2019;18:42–51.
• 20. Bachert C., Schapowal A., Funk P., Kieser M. Treatment of acute rhinosinusitis with the preparation from Pelargonium sidoides EPs 7630: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Rhinology. 2009;47:51–58.
• 21. Perić A., Vezmar Kovačević S., Barać A., Gaćeša D., Perić A.V., Vojvodić D. Effects of Pelargonium sidoides extract on chemokine levels in nasal secretions of patients with non-purulent acute rhinosinusitis. J. Drug Assess. 2020;9:145–150. doi: 10.1080/21556660.2020.1838176.
• 22. Matthys H., Köhler S., Kamin W. Safety and Tolerability of EPs 7630 in Clinical Trials. Adv. Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 2013;2:142. doi: 10.4172/2167-1052.1000142.
• 23. Roth M., Fang L., Stolz D., Tamm M. Pelargonium sidoides radix extract EPs 7630 reduces rhinovirus infection through modulation of viral binding proteins on human bronchial epithelial cells. PLoS ONE. 2019;14:e0210702. doi: 10.1371/journal.pone.0210702.
• 24. Roth M., Sun Q., Tamm M. Up-Regulated Vitamin D Receptor by Pelargonium sidoides Extract EPs® 7630 Contributes to Rhinovirus Defense in Bronchial Epithelial Cells. Pharmaceuticals. 2021;14:172. doi: 10.3390/ph14020172.
• 25. Michaelis M., Doerr H.W., Cinatl J., Jr. Investigation of the influence of EPs^® 7630, a herbal drug preparation from Pelargonium sidoides, on replication of a broad panel of respiratory viruses. Phytomedicine. 2011;18:384–386. doi: 10.1016/j.phymed.2010.09.008.
• 26. Theisen L.L., Muller C.P. EPs^® 7630 (Umckaloabo^®), an extract from Pelargonium sidoides roots, exerts anti-influenza virus activity in vitro and in vivo. Antiviral Res. 2012;94:147–156. doi: 10.1016/j.antiviral.2012.03.006.
• 27. Papies J., Emanuel J., Heinemann N., Kulić Ž., Schroeder S., Tenner B., Lehner M.D., Seifert G., Müller M.A. Antiviral and Immunomodulatory Effects of Pelargonium sidoides DC. Root Extract EPs^® 7630 in SARS-CoV-2-Infected Human Lung Cells. Front. Pharmacol. 2021;12:757666. doi: 10.3389/fphar.2021.757666.
• 28. Kolodziej H. Antimicrobial, Antiviral and Immunomodulatory Activity Studies of Pelargonium sidoides (EPs^® 7630) in the Context of Health Promotion. Pharmaceuticals. 2011;4:1295–1314. doi: 10.3390/ph4101295.
• 29. Witte K., Koch E., Volk H.D., Wolk K., Sabat R. The herbal extract EPs^® 7630 increases the antimicrobial airway defense through monocyte-dependent induction of IL-22 in T cells. J. Mol. Med. 2020;98:1493–1503. doi: 10.1007/s00109-020-01970-3.
• 30. Bao Y., Gao Y., Koch E., Pan X., Jin Y., Cui X. Evaluation of pharmacodynamic activities of EPs^® 7630, a special extract from roots of Pelargonium sidoides, in animals models of cough, secretolytic activity and acute bronchitis. Phytomedicine. 2015;22:504–509. doi: 10.1016/j.phymed.2015.03.004.
• 31. Michi A.N., Love M.E., Proud D. Rhinovirus-Induced Modulation of Epithelial Phenotype: Role in Asthma. Viruses. 2020;12:1328. doi: 10.3390/v12111328.
• 32. Looi K., Buckley A.G., Rigby P.J., Garratt L.W., Iosifidis T., Zosky G.R., Larcombe A.N., Lannigan F.J., Ling K.M., Martinovich K.M., et al. Effects of human rhinovirus on epithelial barrier integrity and function in children with asthma. Clin. Exp. Allergy. 2018;48:513–524. doi: 10.1111/cea.13097.
• 33. Frey A., Lunding L.P., Ehlers J.C., Weckmann M., Zissler U.M., Wegmann M. More Than Just a Barrier: The Immune Functions of the Airway Epithelium in Asthma Pathogenesis. Front. Immunol. 2020;11:761. doi: 10.3389/fimmu.2020.00761.
• 34. Gangl K., Waltl E.E., Vetr H., Cabauatan C.R., Niespodziana K., Valenta R., Niederberger V. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int. Arch. Allergy Immunol. 2015;166:291–296. doi: 10.1159/000430441.
• 35. Esteves P., Allard B., Celle A., Dupin I., Maurat E., Ousova O., Thumerel M., Dupuy J.W., Leste-Lasserre T., Marthan R., et al. Asthmatic bronchial smooth muscle increases rhinovirus replication within the bronchial epithelium. Cell Rep. 2022;38:110571. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110571.
• 36. Witte K., Koch E., Volk H.D., Wolk K., Sabat R. The Pelargonium sidoides Extract EPs 7630 Drives the Innate Immune Defense by Activating Selected MAP Kinase Pathways in Human Monocytes. PLoS ONE. 2015;10:e0138075. doi: 10.1371/journal.pone.0138075.
• 37. Choudhary P., Gutteridge A., Impey E., Storer R.I., Owen R.M., Whiting P.J., Bictash M., Benn C.L. Targeting the cAMP and Transforming Growth Factor-β Pathway Increases Proliferation to Promote Re-Epithelialization of Human Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2016;5:925–937. doi: 10.5966/sctm.2015-0247.
• 38. Yeo N.K., Jang Y.J. Rhinovirus infection-induced alteration of tight junction and adherens junction components in human nasal epithelial cells. Laryngoscope. 2010;120:346–352. doi: 10.1002/lary.20764.
• 39. Sajjan U., Wang Q., Zhao Y., Gruenert D.C., Hershenson M.B. Rhinovirus disrupts the barrier function of polarized airway epithelial cells. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008;178:1271–1281. doi: 10.1164/rccm.200801-136OC.
• 40. Kicic A., Stevens P.T., Sutanto E.N., Kicic-Starcevich E.L., Ling K.M., Looi K., Martinovich K.M., Garratt L.W., Iosifidis T., Shaw N.C., et al. Impaired airway epithelial cell responses from children with asthma to rhinoviral infection. Clin. Exp. Allergy. 2016;46:1441–1455. doi: 10.1111/cea.12767.
• 41. Short K.R., Kasper J., van der Aa S., Andeweg A.C., Zaaraoui-Boutahar F., Goeijenbier M., Richard M., Herold S., Becker C., Scott D.P., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur. Respir. J. 2016;47:954–966. doi: 10.1183/13993003.01282-2015.
• 42. Tan S., Duan H., Xun T., Ci W., Qiu J., Yu F., Zhao X., Wu L., Li L., Lu L., et al. HIV-1 impairs human retinal pigment epithelial barrier function: Possible association with the pathogenesis of HIV-associated retinopathy. Lab. Investig. 2014;94:777–787. doi: 10.1038/labinvest.2014.72.
• 43. Zhao G., Zhang H.M., Qiu Y., Ye X., Yang D. Cleavage of Desmosomal Cadherins Promotes γ-Catenin Degradation and Benefits Wnt Signaling in Coxsackievirus B3-Induced Destruction of Cardiomyocytes. Front. Microbiol. 2020;11:767. doi: 10.3389/fmicb.2020.00767.
• 44. Han H.J., Sung J.Y., Kim S.H., Yun U.J., Kim H., Jang E.J., Yoo H.E., Hong E.K., Goh S.H., Moon A., et al. Fibronectin regulates anoikis resistance via cell aggregate formation. Cancer Lett. 2021;508:59–72. doi: 10.1016/j.canlet.2021.03.011.
• 45. Han S.W., Roman J. Fibronectin induces cell proliferation and inhibits apoptosis in human bronchial epithelial cells: Pro-oncogenic effects mediated by PI3-kinase and NF-kappa B. Oncogene. 2006;25:4341–4349. doi: 10.1038/sj.onc.1209460.
• 46. Pillai D.K., Sankoorikal B.J., Johnson E., Seneviratne A.N., Zurko J., Brown K.J., Hathout Y., Rose M.C. Directional secretomes reflect polarity-specific functions in an in vitro model of human bronchial epithelium. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2014;50:292–300. doi: 10.1165/rcmb.2013-0188OC.
• 47. Hograindleur M.A., Effantin G., Fenel D., Mas C., Lieber A., Schoehn G., Fender P., Vassal-Stermann E. Binding Mechanism Elucidation of the Acute Respiratory Disease Causing Agent Adenovirus of Serotype 7 to Desmoglein-2. Viruses. 2020;12:1075. doi: 10.3390/v12101075.
• 48. Stasiak A.C., Stehle T. Human adenovirus binding to host cell receptors: A structural view. Med. Microbiol. Immunol. 2020;209:325–333. doi: 10.1007/s00430-019-00645-2.
• 49. Campbell E., Pierce J., Endicott S., Shapiro S. Evaluation of extracellular matrix turnover. Methods and results for normal human lung parenchymal elastin. Chest. 1991;99((Suppl. S3)):49S. doi: 10.1378/chest.99.3_Supplement.49S.
• 50. XuChen X., Weinstock J., Arroyo M., Salka K., Chorvinsky E., Abutaleb K., Aguilar H., Kahanowitch R., Rodríguez-Martínez C.E., Perez G.F., et al. Airway Remodeling Factors During Early-Life Rhinovirus Infection and the Effect of Premature Birth. Front. Pediatr. 2021;9:610478. doi: 10.3389/fped.2021.610478.
• 51. Xiang Y., Tan Y.R., Zhang J.S., Qin X.Q., Hu B.B., Wang Y., Qu F., Liu H.J. Wound repair and proliferation of bronchial epithelial cells regulated by CTNNAL1. J. Cell. Biochem. 2008;103:920–930. doi: 10.1002/jcb.21461.
• 52. Kamin W., Funk P., Seifert G., Zimmermann A., Lehmacher W. EPs 7630 is effective and safe in children under 6 years with acute respiratory tract infections: Clinical studies revisited. Curr. Med. Res. Opin. 2018;34:475–485. doi: 10.1080/03007995.2017.1402754.
• 53. Janecki A., Conrad A., Engels I., Frank U., Kolodziej H. Evaluation of anaqueous-ethanolic extract from Pelargonium sidoides (EPs^® 7630) for its activity against group A-streptococci adhesion to human HEp-2 epithelial cells. J. Ethnopharmacol. 2011;133:147–152. doi: 10.1016/j.jep.2010.09.018.
• 54. Prakash Y.S., Halayko A.J., Gosens R., Panettieri R.A., Jr., Camoretti-Mercado B., Penn R.B. ATS Assembly on Respiratory Structure and Function. An Official American Thoracic Society Research Statement: Current Challenges Facing Research and Therapeutic Advances in Airway Remodeling. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017;195:e4–e19. doi: 10.1164/rccm.201611-2248ST.
• 55. Hauer H., Germer S., Elsässer J., Ritter T. Benzopyranones and their sulfate esters from Pelargonium sidoides. Planta Med. 2010;76:350–352. doi: 10.1055/s-0029-1186167.
• 56. Schoetz K., Erdelmeier C., Germer S., Hauer H. A detailed view on the constituents of EPs 7630. Planta Med. 2008;74:667–674. doi: 10.1055/s-2008-1074515.
• 57. Nallathambi R., Poulev A., Zuk J.B., Raskin I. Proanthocyanidin-Rich Grape Seed Extract Reduces Inflammation and Oxidative Stress and Restores Tight Junction Barrier Function in Caco-2 Colon Cells. Nutrients. 2020;12:1623. doi: 10.3390/nu12061623.
• 58. Bianchi M.G., Chiu M., Taurino G., Brighenti F., Del Rio D., Mena P., Bussolati O. Catechin and Procyanidin B2 Modulate the Expression of Tight Junction Proteins but Do Not Protect from Inflammation-Induced Changes in Permeability in Human Intestinal Cell Monolayers. Nutrients. 2019;11:2271. doi: 10.3390/nu11102271.
• 59. Quosdorf S., Schuetz A., Kolodziej H. Different Inhibitory Potencies of Oseltamivir Carboxylate, Zanamivir, and Several Tannins on Bacterial and Viral Neuraminidases as Assessed in a Cell-Free Fluorescence-Based Enzyme Inhibition Assay. Molecules. 2017;22:1989. doi: 10.3390/molecules22111989.
• 60. Wang Z., Gu D., Sheng L., Cai J. Protective Effect of Anthocyanin on Paraquat-Induced Apoptosis and Epithelial-Mesenchymal Transition in Alveolar Type II Cells. Med. Sci. Monit. 2018;24:7980–7987. doi: 10.12659/MSM.910730.
• 61. Wu K.C., Zhong Y., Maher J. Predicting Human Infection Risk: Do Rodent Host Resistance Models Add Value? Toxicol. Sci. 2019;170:260–272. doi: 10.1093/toxsci/kfz116.
• 62. Heinrich M., Jalil B., Abdel-Tawab M., Echeverria J., Kulić Ž., McGaw L.J., Pezzuto J.M., Potterat O., Wang J.B. Best Practice in the chemical characterisation of extracts used in pharmacological and toxicological research-The ConPhyMP-Guidelines. Front. Pharmacol. 2022;13:953205. doi: 10.3389/fphar.2022.953205.
• 63. Fang L., Li J., Papakonstantinou E., Karakioulaki M., Sun Q., Schumann D., Tamm M., Stolz D., Roth M. Secreted heat shock proteins control airway remodeling: Evidence from bronchial thermoplasty. J. Allergy Clin. Immunol. 2021;148:1249–1261.e8. doi: 10.1016/j.jaci.2021.02.022.
• 64. Fang L., Wang X., Sun Q., Papakonstantinou E., S’ng C., Tamm M., Stolz D., Roth M. IgE Downregulates PTEN through MicroRNA-21-5p and Stimulates Airway Smooth Muscle Cell Remodeling. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:875. doi: 10.3390/ijms20040875.
• 65. Lambers C., Boehm P.M., Karabacak Y., Samaha E., Benazzo A., Jaksch P., Roth M. Combined Activation of Guanylate Cyclase and Cyclic AMP in Lung Fibroblasts as a Novel Therapeutic Concept for Lung Fibrosis. BioMed Res. Int. 2019;2019:1345402. doi: 10.1155/2019/1345402.
• 66. Johnson P.R., Black J.L., Carlin S., Ge Q., Underwood P.A. The production of extracellular matrix proteins by human passively sensitized airway smooth-muscle cells in culture: The effect of beclomethasone. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000;162:2145–2151. doi: 10.1164/ajrccm.162.6.9909111.