Динаміка медіаторів запалення у хворих з нейроішемічною формою синдрому діабетичної стопи

Вступ

Запалення — місцева пристосувальна реакція організму у відповідь на різного характеру пошкодження, яка характеризується комплексною місцевою судинно-мезенхімальною реакцією, яка утворилася в ході філогенезу і містить елементи не тільки патології, а й фізіології [1].

У патогенезі запалення беруть участь і впливають на запалення природні неспецифічні реакції: хемотаксис, опсонізація, фагоцитоз, активація комплементу, цитокіни, продукція гістаміну та ін. Велику роль у патогенезі запалення, в тому числі при синдромі діабетичної стопи (СДС), відіграють медіатори запалення — клітинний продукт — цитокіни, які відкрили останніми роками завдяки молекулярній біології та молекулярній генетиці. У продукції цитокінів беруть участь моноцити, макрофаги, нейтрофільні лейкоцити, лімфоцити, клітини ендотелію, фібробласти. Цитокіни, продуковані лейкоцитами, називають інтерлейкінами (ІL), тому що, з одного боку, вони продукуються лейкоцитами, з іншого — лейкоцити є клітинами-мішенями для ІL і цитокінів. Нині відомо більше 20 цитокінів, з них 15 належать до ІL. Цитокіни являють собою порівняно великі молекули білка з молекулярною масою 10–45 кДа. Цитокінова система включає 5 великих класів, об’єднаних за їх домінуючою дією на інші клітини:

• ІL: прозапальні (ІL-1, -6, -8, -12) і антизапальні (ІL-4, -10, -11, -13, ІL-α тощо);
• фактор некрозу пухлини (ФНП)-α;
• фактори росту й диференціювання лімфоцитів;
• фактори, які стимулюють ріст колоній макрофагів і гранулоцитів;
• фактори, які викликають ріст мезенхімальних клітин.

Більшість реакцій при запаленні здійснюється за посередництва цитокінів;

• ІL-1 активує Т- і В-лімфоцити, стимулює утворення білків ранньої фази запалення, продукцію прозапальних медіаторів (ІL-6, ІL-8, ФНП-α), фактора агрегації тромбоцитів, також він підвищує прокоагулянтну активність ендотелію та адгезивність молекул, викликає підвищення температури тіла;
• ІL-2 стимулює продукцію інтерферону, підвищує проліферацію та цитотоксичні властивості Т-лімфоцитів;
• ІL-6 активує Т- і В-лімфоцити й лейкоцити, зумовлює підвищення лейкоцитозу, температури тіла й синтез білків ранньої фази запалення;
• ФНП-α стимулює секрецію ІL-1, ІL-6, виведення простагландинів, посилює акти­вацію нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів. Активує комплемент і коагуляцію, підвищує молекулярну адгезію та проникність судин, викликає розвиток гіпоксії, підвищує температуру тіла;
• фактори, які стимулюють ріст колоній макрофагів і гранулоцитів, стимулюють ріст нейтрофілів, макрофагів, еозинофілів, інтерферон — продукцію ФНП-α, ІL-1, ІL-6.

Цитокіни, які циркулюють у крові, безперервно активують макрофаги, лейкоцити й інші цитокінпродукуючі клітини: виникає їх неконтрольована продукція. У результаті цього поверхня ендотелію набуває підвищеної тромбогенності й адгезивності, виникають мікротромбози, порушується мікроциркуляція, виникають масивна вазодилатація, переповнення венозного русла, різке підвищення проникності судинної стінки, гіпоксія тканин.

Одним із тяжких системних захворювань є цукровий діабет (ЦД), кількість хворих на який постійно зростає. При ЦД виникає безліч ускладнень. Яскравим прикладом запалення є тяжке ускладнення ЦД — СДС, яке може стати для пацієнта серйозним випробуванням, негативно впливати на якість життя та призвести до інвалідизації. Найчастіше хворих із СДС госпіталізують із гнійно-запальними процесами [2].

Загальновідомо, що основою пошкодження різної етіо­логії є запальний процес. Загалом загоєння рани відбувається у 4 етапи: гемостаз, запалення, проліферація та фаза ремоделювання. У регулюванні цих етапів беруть участь різні системи організму [3].

Відмітимо, що макрофаги також секретують цитокіни та фактори росту, що регулюють проліферативну фазу загоєння рани. За допомогою IL-1 та імуноглобуліну G в рані з’являються лімфоцити, на 3-тю–4-ту добу в рану мігрують фібробласти і міофібробласти, що розпочинають проліферативну фазу. Аутокринна регуляція проліферації здійс­нюється за рахунок активації хемотаксису фібробластів, який відбувається під дією трансформуючого фактора росту (TGF)-β, який стимулюється фактором росту сполучної тканини [4, 5]. Паракринна регуляція відбувається шляхом секреції фібробластами фактора росту кератиноцитів, епідермального фактора росту, фактора росту колоній гранулоцитів макрофагів, IL-6, фактора росту фіб­робластів-10 [6, 7]. Вищенаведені цитокіни, впливаючи на кератиноцити, розпочинають синтез колагену. Система зворотного зв’язку забезпечується синтезом кератиноцитами IL-1, який стимулює фібробласти синтезувати фактор росту колоній гранулоцитів і макрофагів. Макрофаги відіграють основну роль в ангіогенезі за рахунок секреції ФНП-α.

Велику роль у фазі запалення відіграє оксид азоту (NO). При виникненні запалення активується ендотелій, який виділяє медіатори запалення, що призводить до виходу молекул клітинної адгезії [8]. Дефіцит ендотеліальної NОS при запальному процесі знижує здатність протизапальних медіаторів послаблювати експресію прозапальних генів. Внаслідок цього зменшується протистояння запаленню [9]. При хронічному пригніченні синтезу NO виникають ранні прояви запальних змін у судинній стінці. Основним фактором впливу на NO при запаленні є оксидативний стрес [10]. Зростання за цих умов продукції вільних радикалів призводить до зниження синтезу NO і формування ендотеліальної дисфункції. Вільні радикали збільшують вміст внутрішньоклітинного кальцію, тим самим активують NOS, що викликає синтез високого рівня NО, що активує окиснення ліпопротеїдів низької щільності, що, своєю чергою, пошкоджує ендотелій [11].

Мета дослідження: вивчити динаміку медіаторів запалення у хворих з нейроішемічною формою СДС.

Об’єкт і методи дослідження

На базі відділення гнійної хірургії КНП «Київська міська клінічна лікарня № 6» протягом 2023 р. на лікуванні перебували 115 пацієнтів із СДС. У дослідження включили 35 хворих із нейроішемічною формою СДС. Їх розподілено за статтю та віком: чоловіків — 22 (62,85%), жінок — 13 (37,15%), середній вік 65,4±6,1 року. У пацієнтів виявлені ішемічна хвороба серця — у 29 (82,85%), гіпертонічна хвороба — у 22 (62,85%), інфаркт міокарда в анамнезі — у 6 (17,14%), енцефалопатія — 11 (31,4). За тяжкістю та глибиною гнійно-некротичного ураження хворих розподіляли за класифікацією Wagner: ІІ стадія — у 2 (5,71%), ІІІ — у 13 (37,14%), ІV — у 15 (42,85%), V — у 5 (14,28%) пацієнтів.

Функціональну активність моноцитів периферичної крові досліджували за допомогою НСТ-тесту у двох варіантах: спонтанному та стимульованому ліпополісахаридом [12]. Концентрацію нітритів і нітратів у плазмі крові визначали шляхом обчислення результатів на основі стандартної калібрувальної кривої для нітриту та нітрату натрію [13].

При вивченні формування місцевої запальної реакції у пацієнтів із СДС отримані дані, представленні в табл. 1.

Таблиця 1. Особливості розвитку перерозподільчих клітинних реакцій у капілярній крові зони некротичного ураження у хворих з СДС

При дослідженні показників загального вмісту лейкоцитів у капілярній крові на 1-шу добу дослідження встановлено зниження їх вмісту відносно капілярної крові на 7-му добу у 2,6 раза (р<0,01) з 4,19±0,44·10⁹/л до 1,63±0,31·10⁹/л.

При цьому визначено, що в зоні некротичного ураження кількість моноцитів та лімфоцитів становила 0,75±0,65 та 0,62±0,54%. На 7-му добу кількість моноцитів збільшилася в 6,4 раза, лімфоцитів — 6,5 раза, що свідчить про позитивну динаміку загоєння рани. Також ранові відбитки характеризувалися значним вмістом ранового детриту та поодинокими фібробластами. Нейтрофільні гранулоцити визначали в стадії дегенеративних змін, їх кількість на 7-му добу дослідження зменшилася у 2 рази, що свідчить про зменшення вираженості запалення.

На 5-ту добу дослідження визначено підвищення кількості лейкоцитів у капілярній крові зони ураження у 2,11 раза відносно вихідних значень (р<0,01). Виявлено підвищення вмісту моноцитів та лімфоцитів відносно вихідних значень у 3,74 (р<0,01) та 2,79 (р<0,01) раза відповідно. Встановлено зниження показників вмісту нейтрофільних гранулоцитів у стадії завершеного фагоцитозу до 15,7% (р<0,01). Визначено зменшення вмісту тканинного детриту. Встановлено наявність фібробластів, розташованих групами.

На 7-му добу досліджень виявлена тенденція до подальшого збільшення загальної кількості лейкоцитів у капілярній зоні некротичного ураження по відношенню до вихідних значень у 2,57 раза (р<0,01). У той самий час встановлено підвищення вмісту моноцитів та лімфоцитів у капілярній крові зони некротичної рани по відношенню до вихідних значень у 6,41 раза (р<0,001) та 6,53 раза (р<0,001) відповідно. Кількість нейтрофільних гранулоцитів у стадії завершеного фагоцитозу на 1-шу добу становила 98,71%, на 7-му — 49,61, що в 1,98 раза (р<0,05) менше по відношенню до даних у 1-шу добу досліджень. Визначена наявність фібробластів, у значній кількості розташованих групами.

На 7-му добу число моноцитів було збільшено в 6,4 раза, лімфоцитів — в 6,5 раза, що свідчить про позитивну динаміку загоєння рани.

Результати дослідження функціональної активності моноцитів капілярної крові зони некротичного ураження у хворих з нейроішемічою формою СДС представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Показники функціональної активності моноцитів у капілярній крові зони некротичного ураження у хворих з СДС

При дослідженні функціональної активності моноцитів капілярної крові зони некротичного ураження встановлено значне її підвищення відносно референтних значень у 1-й термін дослідження в спонтанному тесті в 1,82 раза (р<0,01) при значному зниженні в індукованому тесті — в 4,94 раза (р<0,001) при індексі стимуляції 0,11 у.о. (референтні значення — 1,00 у.о.).

У 2-й термін досліджень (5-та доба) встановлена тенденція до зниження показників функціональної активності моноцитів капілярної крові зони ранового пошкодження в спонтанному тесті в 1,33 (р<0,05) та підвищення в індукованому у 2,12 раза (р<0,05) по відношенню до вихідних значень. Індекс стимуляції становив у цей термін дослідження 0,31 у.о., що свідчить про тенденцію до залучення в рану функціонально активних клітин природної резистентності.

Показники функціональної активності моноцитів капілярної крові зони ранового ураження демонстрували динаміку до зниження і в 3-й термін дослідження (7-ма доба). Показники спонтанного НСТ-тесту були знижені в 1,90 раза (р<0,05) стосовно вихідного значення. У той самий час в індукованому тесті підвищення зафіксоване у 2,67 раза (р<0,01). Індекс стимуляції становив 0,57 у.о.

Отримані результати дослідження функціональної активності моноцитів у капілярній крові зони ранового ураження свідчать про тенденцію до відновлення функції моноцитів — головних ефекторних клітин справжнього фагоцитозу, що сприяє оптимізації перебігу місцевого запалення у пацієнтів із СДС.

При визначенні вмісту кінцевих продуктів NO у хворих цієї крупи в капілярній крові зони ранового ураження встановлено значне зниження їх продукції в 1-й термін дослідження по відношенню до референтних значень у 2,58 раза (р<0,05) (табл. 3).

Таблиця 3. Динаміка змін кінцевих продуктів NO в капілярній крові зони некротичного ураження

При цьому в 2-й термін дослідження встановлена тенденція до підвищення вмісту продукції NO по відношенню до вихідних значень в 1,57 раза (р<0,05). У подальшому ця тенденція зберігалася. Показники вмісту продуктів NO в капілярній крові зони ранового ураження в 3-й термін дослідження перевищували вихідні показники в 1,92 раза (р<0,05).

При вивченні особливості формування запальної реакції у пацієнтів із СДС визначені рівні про- та антизапальних цитокінів у капілярній крові зони ранового ураження (табл. 4).

Таблиця 4. Показники про- та антизапальних цитокінів у капілярній крові зони ранового ураження у хворих з СДС

У результаті проведених досліджень встановлено, що у хворих обстеженої групи показники вмісту IL-1 в капілярній крові зони некротичного ураження були підвищені відносно референтних показників у 3,56 раза (р<0,05) в 1-й термін дослідження (1-ша доба). При цьому показники вмісту IL-4 перевищували референтні в 1,63 раза (р<0,05). Встановлено підвищення продукції IL-6 при зниженні IL-10 відносно референтних значень в 1,19 (р<0,05) та 1,17 (р<0,05) раза відповідно. Вміст ФНП-α в капілярній крові зони некротичного ураження був у 2,1 раза (р<0,05) вищим за референтні показники.

У 2-й термін дослідження (5-та доба) виявлена тенденція до зниження продукції IL-1 та IL-4 в 1,31 (р<0,05) та 1,20 раза (р<0,05) відповідно та IL-6 в 1,16 раза (р<0,05). При цьому визначено підвищення вмісту IL-10 в 1,16 раза (р<0,05) та ФНП-α в 3,18 раза (р<0,01).

У 3-й термін дослідження (7-ма доба) встановлено зниження показників вмісту IL-1 відносно вихідних значень у 2,09 раза (р<0,05). Визначена тенденція до зниження продукції IL-4 в 1,42 раза (р<0,05), IL-6 — 1,23 раза (р<0,05) та IL-10 в 1,18 раза відносно вихідних значень. Концентрація ФНП-α в капілярній крові зони ранового ураження була в 3,63 раза вищою (р<0,01) відносно вихідних значень.

При порівнянні результатів досліджень відмічено позитивну динаміку та ангіогенез у зоні ранового ураження.

Динаміка показників вмісту TGF-β та фібронектину в капілярній крові зони некротичного ураження у хворих з нейроішемічною формою СДС представлені в табл. 5.

Таблиця 5. Показники вмісту TGF-β та фібронектину в капілярній крові зони ранового ураження у хворих з СДС

У пацієнтів групи порівняння встановлено зниження вихідних показників вмісту TGF-β по відношенню до референтних значень в 1,075 раза. Також встановлено зниження продукції фібронектину 1,17 раза (р<0,05).

При цьому встановлено, що в 2-й термін дослідження показники вмісту TGF-β в 1,90 раза (р<0,01) та фібронектину в 1,59 раза (р<0,05) перевищували вихідні значення.

У 3-й термін дослідження встановлена тенденція до підвищення вмісту TGF-β та фібронектину відносно вихідних значень в 1,47 (р<0,01) та 1,51 (р<0,01) раза відповідно.

Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлено, що у хворих з СДС в капілярній крові зони ранового ураження відмічено зниження загального вмісту лейкоцитів. При цьому встановлено зниження вмісту моноцитів та лімфоцитів при підвищенні вмісту нейтрофільних гранулоцитів з апоптотичними змінами. Після завершення своєї функції між 3-м і 5-м днем загоєння ран нейтрофіли зазвичай піддаються апоптозу з подальшим поглинанням макрофагами. Однак якщо процес порушений тією чи іншою мірою, це може призвести до тривалого знаходження нейтрофільних гранулоцитів з апоптичними змінами в рановому середовищі. Нейтрофіли також виділяють MMP-8 та серинові протеази, такі як еластаза, які руйнують важливі фактори росту, такі як PDGF та TGF-β. Це пов’язано з уповільненим відновленням хронічних ран (виразок) у пацієнтів із ЦД [14].

При визначенні функціонального стану моноцитів встановлено підвищення рівня моноцитів прозапального типу реагування (високі показники спонтанного НСТ-тесту).

Макрофаги / моноцити переважно відповідають за елімінацію апоптотичних нейтрофілів і беруть участь у контролі процесу запалення за допомогою трансформації фенотипу. Однак макрофаги, які виявляють у хронічних ранах, мають обмежену здатність знищувати апоптотичні нейтрофіли і виявляють аномальне диференціювання. Встановлено, що в капілярній крові у обстежених хворих міститься надмірна кількість прозапальних моноцитів (фенотип М1), тоді як кількість макрофагів з протизапальним фенотипом низька (фенотип М2) [15]. Це призводить до створення високозапального середовища з надлишком медіаторів запалення. Ці багатофакторні стимули створюють і посилюють вороже мікросередовище хронічних ран з порушенням балансу між прозапальними цитокінами, хемокінами, протеазами та їх інгібіторами, що існує в нормальних ранах. Отже, біодоступність знижується, хоча у хронічних ранах продукція чинників зростання зазвичай підвищується. Як нейтрофіли, так і активовані макрофаги продукують прозапальні цитокіни, такі як IL-1β і ФНП-α, які зумовлюють саме підтримання запального процесу. Активовані макрофаги секретують хемокіни, цитокіни та фактори росту, такі як TGF-α, TGF-β, основ­ний фактор росту фібробластів (bFGF), PDGF та фактор росту ендотелію судин (VEGF), для посилення та, зрештою, усунення запалення. Однак тривала наявність макрофагів у рановому середовищі та персистуюче запалення можуть призвести до пошкодження тканин та хронізації ран. Нездатність макрофагів поляризуватися від прозапального M1 до репаративного фенотипу M2 може викликати хронічні рани [16]. Ця недостатність зумовлена гіперекс­пресією медіаторів запалення, таких як IL-1, індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS) та активних форм кисню (АФК), а також порушенням кліренсу апоптотичних нейтрофілів макрофагами, що негативно впливає на мікрооточення рани, яке призводить до великої частки прозапальних цитокінів [17].

На додаток до імунних дисбалансів низький вміст NO та надмірне виробництво АФК відповідальні за перешкоду загоєнню хронічних ран. NO є ендогенним нейротрансмітером, який відіграє ключову роль у регуляції запалення, але рівні NO в хронічних ранах набагато нижчі за норму. Крім того, надлишок АФК може спричинити окисне пошкодження рани, порушення неоваскуляризації та метаболічне пошкодження, що може продовжити запалення. Кінцеві продукти підвищеного глікозилювання (AGE) в діабетичних ранах можуть індукувати надмірне вироблення АФК, що призводить до значного окиснювального пошкодження і старіння позаклітинного матриксу і клітинної мембрани, в кінцевому підсумку викликаючи поганий ангіогенез і реепітелізацію, недостатнє вироблення факторів росту і проникнення [18–21].

Порушення загоєння ран при виразках, пов’язаних із ЦД, характеризується вираженим прозапальним профілем. Цей прозапальний профіль викликаний надмірною експресією запальних цитокінів, таких як ФНП-α, та зниженою продукцією медіаторів загоєння, таких як IL-10 та TGF-β. Це призводить до поляризації макрофагів у бік фенотипу М1 та активації та дегрануляції CD8+ Т-клітин, що призводить до некрозу тканин. У капілярній крові зони ранового ураження встановлено підвищення продукції IL-4, який є критичним ефекторним цитокіном при загоєнні ран при ЦД. Він пригнічує експресію генів, індуковану під час диференціювання кератиноцитів. IL-4 порушує реакцію кератиноцитів на загоєння ран за рахунок зниження вироблення фібронектину [22, 23]. Підвищення експресії IL-6 пов’язане зі зниженням експресії TGF-β, після чого транссигналізація IL-6 стимулює продукцію TGF-β [24].

Відомо, що TGF-β є сильним стимулятором, який у великій кількості активує міграцію клітин, утворення грануляційної тканини. TGF-β активує проліферативний потенціал фібробластів у сполучній тканині. Підвищення вмісту TGF-β у капілярній крові свідчить про оптимізацію репаративних процесів та є прогностичним критерієм оптимізації процесів загоєння хронічних ран у хворих з ЦД.

Основна функція фібронектину — зв’язувати клітини з позаклітинною речовиною. Він сприяє адгезії та поширенню епітеліальних та мезенхімальних клітин, стимулює проліферацію та міграцію, контролює диференціацію та підтримку клітинного цитоскелета. Роль фібронектину в запаленні, регенерації та загоєнні ран важлива. Під час запалення фібробласти розмножуються і мігрують до місця пошкодження під впливом цитокінів, що виділяються макрофагами. Вони взаємодіють із волокнистими структурами через фібронектин, який створює шляхи міграції клітин. Фрагменти цього глікопротеїну є також одним із хіміоактивних речовин для макрофагів, що мігрують до вогнища запалення.

Висновки

У хворих з нейроішемічною формою СДС відзначається значне підвищення рівня прозапальних цитокінів (IL-1, IL-6, ФНП-α) у капілярній крові зони некротичного ураження, що є основним маркером тривалого запального процесу.

Протизапальні цитокіни (IL-10, TGF-β) демонструють тенденцію до підвищення на пізніших етапах загоєння ран, що свідчить про активацію механізмів репаративного загоєння.

Порушення співвідношення прозапальних і антизапальних цитокінів призводить до затримки переходу запальної фази у проліферативну, що є характерним для хронічних ран у пацієнтів із ЦД.

Відзначено надмірну активність моноцитів із прозапальним фенотипом (М1) і недостатнє формування репаративних макрофагів (М2), що зумовлює хронізацію запального процесу.

Підвищення вмісту TGF-β і фібронектину в капілярній крові на пізніх етапах дослідження є позитивними прогностичними ознаками, що вказують на активацію репаративних процесів і поліпшення загоєння хронічних ран.

Отримані дані можуть бути використані для вдосконалення терапевтичних стратегій у лікуванні пацієнтів із СДС з урахуванням індивідуальних показників запальної реакції.

Список використаної літератури

Надійшла до редакції/Received: 29.03.2025
Прийнято до друку/Accepted: 19.04.2025