Терапия заболеваний на уровне РНК
Пациентов с заболеваниями, такими как мышечная атрофия и гиперлипидемия, теперь можно лечить с помощью подходов, которые действуют на рибонуклеиновую кислоту (РНК). С помощью информации о секвенировании человеческого генома можно синтезировать олигонуклеотиды, позволяющие изменить экспрессию любого белка.
Хотя концепция использования синтетических олигонуклеотидов для модуляции функции РНК была описана еще в 1978 г., ее реализация в форме лекарственных средств потребовала углубленных исследований в области геномики, химии, фармакологии.
В данном направлении 3 января 2019 г. в «Журнале медицины Новой Англии» («The New England Journal of Medicine») была опубликована статья доктора философии A. Levin из Сан-Диего (Калифорния, США). Данная информация необходима для последующего применения препаратов олигонуклеотидов в практике врача.
Механизмы действия
Терапевтические олигонуклеотиды, как правило, имеют длину от 15 до 30 нуклеотидов и комплементарны конкретной области матричной РНК (мРНК), кодирующей связанный с заболеванием белок или регуляторную РНК. После парентерального введения олигонуклеотид входит в клетку и связывается с любой комплементарной РНК.
Как только олигонуклеотидное лекарственное средство связывается со своей комплементарной мРНК или пре-мРНК, происходит ряд событий. Результаты включают:
- разрушение мРНК с помощью ферментативного расщепления (необходимо, когда мРНК мутирует и кодирует патогенный белок);
- изменение паттерна сплайсинга пре-мРНК (требуется, когда из пре-мРНК производится патогенный продукт);
- изменение функции регуляторной РНК.
Одобренные в настоящее время олигонуклеотидные препараты вызывают расщепление мРНК или изменяют схему сплайсинга.
Терапевтические механизмы
Только небольшая часть генетической информации в геноме человека транслируется в белки. Например, ДНК, кодирующая дистрофин, распределена по области из 2,4 млн пар оснований, но мРНК дистрофина состоит примерно из 14 000 оснований. Процесс сплайсинга и редактирования пре-мРНК является пунктом генетической регуляции. Пре-мРНК можно редактировать с помощью альтернативного сплайсинга, чтобы получить разные изоформы белка, которые могут иметь разные, а иногда и противоположные функции.
Терапия мышечной дистрофии Дюшенна
Мышечная дистрофия Дюшенна (Duchenne muscular dystrophy) — это заболевание с неизменно летальным исходом, вызванное мутациями в любом из 79 экзонов гена, кодирующего дистрофин, локализованном в области короткого плеча 21-й хромосомы. Неспособность продуцировать дистрофин приводит к нарушению связи элементов цитоскелета и сарколеммы. У пациентов с этим заболеванием сокращения мышц вызывают разрывы сарколеммы, повреждение клеток, гибель клеток, некроз и в конечном итоге — потерю мышечной функции.
Этеплирсен (eteplirsen), олигонуклеотидный агент, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration — FDA). Этеплирсен функционирует путем гибридизации в экзоне 51 пре-мРНК, тем самым блокируя механизм мРНК-процессинга патологического гена. Экзон 52 соединен с экзоном 50, создает укороченную, но функциональную версию дистрофина, и в результате более дистальные нижестоящие экзоны считываются путем трансляции.
Целью лечения является преобразование мутации в экзонах DMD в делецию путем исключения экзона 51. В результате происходит переход к более мягкому фенотипу патологии дистрофина (напоминающего мышечную дистрофию Беккера).
Лечение пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна с помощью еженедельного внутривенного введения этеплирсена привело к незначительному увеличению укороченного дистрофина. Одна из причин слабой активности этеплирсена заключается в том, что большая часть препарата быстро выводится посредством клубочковой фильтрации и лишь незначительное количество поглощается скелетными мышцами. Доставка к тканям-мишеням остается ключевой проблемой в разработке олигонуклеотидных лекарственных средств.
Терапия спинальной мышечной атрофии
Спинальная мышечная атрофия, или проксимальная спинальная амиотрофия, является аутосомно-рецессивным заболеванием.
Причиной является мутация в гене, кодирующем белок, способствующий выживанию моторных нейронов (survival of motor neuron protein — SMN). Дефицит этого белка приводит к гибели моторных нейронов. Область, кодирующая белок SMN, расположена на 5-й хромосоме в локусе 5q13 и состоит из гена SMN1 и псевдогена SMN2. Псевдоген отличается от гена всего одним нуклеотидом, но эта разница приводит к тому, что у 80–90% транскриптов SMN2 отсутствует экзон 7. Такой транскрипт не дает начала функциональному белку, и, следовательно, псевдоген SMN2 обеспечивает всего около 1/10 общего количества функционального белка в клетке. Иногда в геноме присутствуют несколько идущих подряд копий SMN2.
Примерно 95% случаев спинальной мышечной атрофии 1–3-го типов вызваны делецией 7-го и/или 8-го экзона гена SMN1. Остальные 5% — точечными мутациями в этом же гене. Если продукт гена SMN1 нефункционален, то благодаря SMN2 все еще остается небольшое количество белка. Поэтому большее число копий SMN2 связано с более мягкой формой заболевания.
Атрофия мышц позвоночника проявляется в виде мышечной слабости, особенно затрагивающей мышцы, которые участвуют в поддержании положения головы. Дегенерация моторных нейронов в вентральном роге сопровождается потерей дыхательной функции и смертью.
Фракцию SMN2, которая транслируется в функциональный белок, можно увеличить с использованием олигонуклеотида нусинерсена (nusinersen), чтобы индуцировать экспрессию экзона 7 и сформировать достаточное количество функционального белка SMN.
Лечение нусинерсеном способствовало выработке функционального белка SMN, спасению моторных нейронов и нормальному развитию нейронов. Химические модификации обеспечивают устойчивость олигонуклеотида к нуклеазам, увеличивая период полувыведения, поэтому нусинерсен можно вводить нечасто.
Успешные клинические исследования, в которых 4 нагрузочные дозы использовались в течение 1 мес лечения, а затем поддерживающие дозы — каждые 4 мес, приводили к статистически значимому улучшению моторной функции у младенцев и детей старшего возраста.
Терапия гомозиготной гиперхолестеринемии
Мипомерсен (mipomersen) представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид с последовательностью, которая комплементарна части РНК, кодирующей аполипопротеин В — компонент холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), который вырабатывается в печени. Двадцатимерный олигонуклеотид химически модифицирован для увеличения его сродства к РНК. Центральная часть последовательности мипомерсена обладает ДНК-подобными свойствами, и когда мипомерсен гибридизуется до пре-мРНК для аполипопротеина В, присутствие гетеродуплекса ДНК-РНК активирует РНКазу Н, которая расщепляет мРНК в гетеродуплексе. Расщепление дезактивирует мРНК аполипопротеина В, тем самым уменьшая количество продуцируемого аполипопротеина В. В результате экспорт холестерина ЛПНП из печени снижается, и в конечном итоге уровни холестерина ЛПНП в крови снижаются даже у пациентов, для которых терапия статинами неэффективна. FDA одобрило мипомерсен в 2013 г. для терапии гомозиготной гиперхолестеринемии.
Терапия идиопатической гиперхолестеринемии
Инклисиран (inclisiran) является экспериментальным терапевтическим средством, которое вызывает расщепление мРНК, кодирующей пропротеин конвертазу субтилизин-кексина типа 9 (proprotein convertase subtilisin-kexin 9 —PCSK9) — фермент, который регулирует работу рецептора ЛПНП. Связывание PCSK9 с доменом рецептора ЛПНП приводит к деградации рецептора, что, в свою очередь, вызывает пониженный метаболизм ЛПНП, что может привести к гиперхолестеринемии.
Снижение уровня PCSK9 приводит к повышению эффективности работы рецептора и, как следствие этого, к понижению концентрации холестерина в крови. У пациентов наблюдается пониженный уровень холестерина ЛПНП и снижение риска сосудистых катастроф.
Инклисиран химически модифицирован для повышения его устойчивости к эндогенным нуклеазам, что обеспечивает длительный эффект терапевтической активности после каждой введенной дозы. Фактически однократная доза инклисирана продемонстрировала клиническую активность в течение более 3 мес в клинических испытаниях.
Терапия транстиретинового амилоидоза
Препараты, которые запускают РНКаза-H-опосредованное и RISC-опосредованное расщепление (индуцированный РНК комплекс сайленсинга — RNA induced silencing complex — RISC), применяются для лечения транстиретинового амилоидоза. При этой форме амилоидоза мутации белка транстиретина (transthyretin — TTR) вызывают неправильное сворачивание белкового продукта, что приводит к образованию амилоидных отложений во многих тканях, включая периферические нейроны и сердце.
FDA одобрило препарат, предназначенный для лечения пациентов с наследственным транстиретиновым амилоидозом. Препарат патизиран (patisiran) блокирует синтез мутированного белка TTR, который в нормальной форме переносит гормон щитовидной железы тиротин и витамин ретинол.
В 2018 г. комиссией FDA выдано регистрационное свидетельство на препарат инотерсен (inotersen), блокирующий продукцию транстиретина. Как показали клинические исследования, использование лекарственного средства позволяет примерно на 80% снизить уровень транстиретина вне зависимости от типа мутации и стадии заболевания. Препарат необходимо вводить подкожно 1 раз в неделю.
Преимущества и риски использования олигонуклеотидов
В принципе, преимущество лечения на основе олигонуклеотидов заключается в том, что для идентификации кандидатов для терапии требуется только определение области-мишени РНК, которая связана с патологическим процессом.
Введение олигонуклеотидов связано с активацией врожденного иммунитета через взаимодействие с toll-подобными рецепторами (toll-like receptor — TLR). Некоторые олигонуклеотиды связываются с TLR и индуцируют иммунные ответы, аналогичные тем, которые индуцируются вирусной и бактериальной РНК и ДНК. Эти иммуностимулирующие эффекты можно минимизировать, используя химические модификации.
Другие проблемы включают накопление в почках. Одноцепочечные олигонуклеотиды, как правило, защищены от клубочковой фильтрации, поскольку они связаны с белками плазмы крови. Однако небольшая несвязанная фракция легко реабсорбируется клетками почечных проксимальных канальцев. У некоторых пациентов после лечения определенными фосфоротиоатными олигонуклеотидами сообщалось о легкой низкомолекулярной протеинурии и в более редких случаях — гломерулярном нефрите.
По крайней мере три фосфоротиоатных олигонуклеотида вызвали выраженную тромбоцитопению у небольших подгрупп пациентов в клинических исследованиях.
Все наблюдаемые токсические эффекты зависят от дозы. Некоторые побочные эффекты могут быть сведены к минимуму с помощью новых версий олигонуклеотидных препаратов.
На данный момент разрабатываются олигонуклеотиды для терапии гепатоцеллюлярной карциномы и кожной Т-клеточной лимфомы, что является крайне необходимым направлением.
- Levin A.A. (2019) Treating Disease at the RNA Level with Oligonucleotides. N. Engl. J. Med., 380(1): 57–70. doi: 10.1056/NEJMra1705346.
Маргарита Марчук
