Вступ
Інсульт у дитячому віці — мультифакторне захворювання, якому не властива значна поширеність, але в останні роки спостерігається загальна тенденція до підвищення його частоти (Zadro R., Herak D.C., 2012). Важливим напрямком у розробці профілактичних заходів є дослідження етіологічних факторів. Складності, пов’язані з визначенням етіологічних факторів у розвитку ішемічного інсульту (IшIн) у дітей, зумовлюють високу значущість дослідження цієї проблеми. Основні фактори, які можуть вплинути на розвиток IшIн у дитячому віці, детально описуються, встановлюються причини захворювання на молекулярному рівні, розробляються різні методи прогнозування (Смульська Н.О. та співавт., 2013). На сьогодні вивчається роль генетичної компоненти (або спадкової схильності) у зростанні ризику розвитку IшIн у дітей. Результати багатьох досліджень свідчать про підвищення частоти мутацій FV G1691A та FІІ G20210А у дітей з IшIн (Duran R. et al., 2005; Herak D.C. et al., 2009; Kenet G. et al., 2010); менше робіт присвячено генам фолатного обміну та серцево-судинного стану (Panigrahi I. et al., 2006; Arsene D. et al., 2011). На особливу увагу заслуговує необхідність застосування комплексного підходу з урахуванням міжгенної взаємодії для чіткої оцінки внеску генетичної компоненти у розвиток IшIн у дітей.
Мета проведеного нами дослідження — встановлення ролі поліморфних варіантів генів фолатного обміну — MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTRR (A66G), генів факторів згортання крові — FV (G1691A), FII (G20210A), гена серцево-судинного стану — ACE (I/D), їх комбінацій та міжгенної взаємодії у розвитку IшIн у дітей.
Об’єкт і методи дослідження
Дизайн дослідження передбачав проведення порівняння частот генотипів у хворих та здорових дітей за принципом випадок — контроль. До проведення дослідження було залучено 91 дитину віком 0–15 років, які перебували на лікуванні у Міській клінічній дитячій лікарні № 1 м. Києва у період 2009–2013 рр. У 47 дітей, віднесених до основної групи, виявлено зміни у неврологічному статусі протягом ≥24 год на момент включення у дослідження; усім їм встановлено діагноз «гостре порушення мозкового кровообігу за ішемічним типом». Підтвердження діагнозу та верифікацію характеру змін проводили за допомогою методів нейровізуалізації — магнітно-резонансної томографії (МРТ) та/або комп’ютерної томографії (КТ) головного мозку. Критеріями виключення із основної групи були вік хворих >15 років та наявність змін у неврологічному стані, які не були зумовлені наявністю гострої ішемії головного мозку. Група контролю включала 44 дитини віком 0–15 років, які не мали гостро розвинутих неврологічних змін під час обстеження та в анамнезі. Групи значуще не відрізнялися за статевим співвідношенням (p>0,05).
Матеріалом для дослідження була периферична кров дітей, яку забирали у стерильних умовах в моновети об’ємом 1,2 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти як антикоагулянта («Sarstedt», Німеччина). Поліморфні варіанти генів MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTRR (A66G), FV (G1691A), FII (G20210A), ACE (I/D) аналізували, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) з подальшою візуалізацією у 2% агарозному гелі. Отримані результати частоти наявності поліморфних варіантів генів факторів згортання крові (FV, FII, ACE), генів метаболізму фолієвої кислоти (MTHFR, MTR) у групі дітей з IшIн та здорових дітей підлягали статистичному аналізу (програма Statistica 6.0) з визначенням χ2-критерію Пірсона з використанням поправки Єтса на безперервність і співвідношення шансів (СШ) при 95% довірчому інтервалі (ДІ). Біоінформативний метод Multifactor Dimentionality Reduction (MDR) з використанням статистичної програми MDR-2.0_beta_7 дозволив побудувати статистичну модель з найбільшим потенціалом прогнозування ризику розвитку ІшІн (Chung Y. et al., 2007; Sucheston L. et al., 2010). Статистично достовірними вважали відмінності при p<0,05.
Результати та їх обговорення
На першому етапі нами досліджено можливий вплив поліморфних варіантів за генами MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTRR (A66G), FV (G1691A), FII (G20210A), ACE (I/D) на розвиток IшIн у дітей (табл. 1).
у дітей основної та контрольної груп
| Ген/поліморфізм | Генотип | Основна група (n=47) | Група контролю (n=44) | Статистичний аналіз | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| n | % | n | % | χ2 | p | СШ | 95% ДІ | ||
| MTHFR (C677T) | СС | 12 | 25,53 | 27 | 61,36 | 10,5 | 0,015* | 0,22 | 0,09–0,54 |
| CT | 26 | 55,32 | 15 | 34,09 | 4,19 | 0,041* | 2,39 | 1,02–5,42 | |
| TT | 9 | 19,15 | 2 | 4,55 | 4,56 | 0,033* | 4,57 | 1,01–24,48 | |
| СT+TT | 35 | 74,47 | 17 | 38,64 | 9,50 | 0,001* | 4,63 | 1,90–11,30 | |
| MTHFR (A1298C) | AA | 17 | 36,17 | 27 | 61,36 | 4,81 | 0,028* | 0,36 | 0,15–0,83 |
| AC | 22 | 46,81 | 11 | 25,00 | 4,64 | 0,031* | 2,64 | 1,08–6,44 | |
| CC | 8 | 17,02 | 6 | 13,64 | 0,20 | 0,654 | 1,27 | 0,47–3,88 | |
| AC+CC | 30 | 63,82 | 17 | 38,64 | 4,81 | 0,028* | 2,80 | 1,20–6,56 | |
| MTRR (A66G) | AA | 12 | 25,53 | 26 | 59,09 | 9,19 | 0,002* | 0,24 | 0,10–0,58 |
| AG | 17 | 36,17 | 10 | 22,73 | 1,38 | 0,241 | 1,93 | 0,77–4,88 | |
| GG | 18 | 38,30 | 8 | 18,18 | 4,51 | 0,034* | 2,79 | 1,06–7,34 | |
| AG+GG | 35 | 74,47 | 18 | 40,91 | 9,19 | 0,002* | 4,21 | 1,73–10,25 | |
| ACE (I/D) | II | 12 | 25,53 | 25 | 56,82 | 7,97 | 0,014* | 0,26 | 0,11–0,63 |
| ID | 20 | 42,55 | 13 | 29,55 | 1,15 | 0,284 | 1,77 | 0,74–4,21 | |
| DD | 15 | 31,91 | 6 | 13,64 | 4,23 | 0,036* | 2,97 | 1,03–8,54 | |
| ID+DD | 35 | 74,47 | 19 | 43,18 | 7,97 | 0,005* | 3,84 | 1,58–9,31 | |
| FV (G1691A) | GG | 45 | 95,74 | 42 | 95,45 | 0 | 0,946 | 1,07 | 0,14–7,95 |
| GA | 2 | 4,26 | 2 | 4,55 | 0 | 0,946 | 0,93 | 0,13–6,93 | |
| AA | 0 | 0,00 | 0 | 0,00 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| FII (G20210A) | GG | 45 | 95,74 | 43 | 97,73 | 0,28 | 0,596 | 0,52 | 0,05–5,98 |
| GA | 2 | 4,26 | 1 | 2,27 | 0,28 | 0,596 | 1,91 | 0,17–21,85 | |
| AA | 0 | 0,00 | 0 | 0,00 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Комбінації генотипів | Основна група(n=47) | Група контролю(n=44) | Статистичні параметри | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| n | % | n | % | χ² | СШ | p | 95% ДІ | |
| MTHFR (C677T)+MTHFR(A1298C) | ||||||||
| CC/AA | 2 | 4,26 | 17 | 38,64 | 14,25 | 0,07 | 0,002 | 0,02–0,33 |
| CT/AC | 13 | 27,66 | 4 | 9,09 | 5,16 | 3,82 | 0,023 | 1,14–12,83 |
MTHFR (C677T)+MTRR(A66G) |
||||||||
| CC/AA | 3 | 6,38 | 19 | 43,18 | 14,84 | 0,09 | 0,001 | 0,02–0,33 |
| TT/GG | 7 | 14,89 | 0 | 0,00 | 5,16 | – | 0,023 | – |
MTHFR (C677T)+ACE(I/D) |
||||||||
| CC/II | 3 | 6,38 | 20 | 45,45 | 16,36 | 0,08 | 0,001 | 0,02–0,30 |
MTHFR (A1298C)+MTRR (A66G) |
||||||||
| AA/AA | 3 | 6,38 | 15 | 34,09 | 9,32 | 0,13 | 0,020 | 0,04–0,50 |
MTHFR (A1298C)+ACE (I/D) |
||||||||
| AA/II | 5 | 10,64 | 17 | 36,17 | 8,25 | 0,19 | 0,010 | 0,06–0,57 |
| AC/ID | 11 | 23,40 | 3 | 6,82 | 5,45 | 5,23 | 0,030 | 1,37–19,86 |
| CC/DD | 6 | 12,77 | 0 | 0,00 | 4,12 | – | 0,042 | – |
MTRR (A66G)+ACE (I/D) |
||||||||
| AA/II | 4 | 8,51 | 17 | 38,64 | 9,98 | 0,15 | 0,020 | 0,04–0,49 |
| GG/ID | 13 | 27,66 | 3 | 6,82 | 5,52 | 5,31 | 0,030 | 1,36–18,95 |
MTHFR (C677T)+MTHFR (A1298C)+MTRR (A66G)+ACE (I/D) |
||||||||
| CC/AA/AA/II | 0 | 0,00 | 10 | 22,73 | 8,25 | – | 0,004 | – |
В основній групі відзначено підвищення частоти генотипів 677СТ (СШ 2,39) та 677ТТ (СШ 4,57) і найбільше зростання при їх поєднанні генотипів СТ+ТТ (СШ 4,63) за геном MTHFR. При проведенні порівняльного аналізу за поліморфізмом А1298С гена MTHFR статистично значимим був генотип СС (СШ 1,27). Проте сумарне поєднання генотипів AC+CC призводило до значного зростання ризику розвитку IшIн (СШ 2,80). Подібний розподіл встановлено і за генами MTRR та АСЕ. Виявлено асоціацію генотипу GG (СШ 2,79) та генотипу DD (СШ 2,97) з розвитком IшIн у дітей. Найбільше зростання ризику розвитку IшIн у дітей спостерігали при поєднанні генотипів AG+GG (СШ 4,21) і генотипів ID+DD (СШ 3,84) (див. табл. 1).
Статистично значиме підвищення частоти генотипів 677CC, 1298AA за геном MTHFR, 66AA — за геном MTRR; II — за геном АСЕ у дітей групи контролю свідчить про протекторну дію цих генотипів у розвитку захворювання. Висока достовірність отриманих даних свідчить про значимість саме цих трьох досліджуваних нами генів (як в гомо-, так і гетерозиготному станах) у розвитку IшIн у дітей.
На противагу описаним у літературі асоціаціям Лейденської мутації (FV (G1691A)) та мутації в гені протромбіну (FII (G20210A)) з IшIн у дорослих, нами не виявлено достовірних відмінностей за цими генами у дітей, тому в подальшій роботі ці генотипи не аналізували.
На рис. 1 проілюстрована виявлена нами протилежність частот генотипів із різними алельними варіантами кожного дослідженого гена у дітей з IшIн та в контрольній групі.
За допомогою MDR нами виявлені всі можливі комбінації поліморфних варіантів досліджуваних генів та побудована графічна модель взаємодії комбінацій досліджуваних генотипів (рис. 2) для оцінки їх взаємного впливу на розвиток IшIн у дітей. Встановлено, що деякі комбінації виявляють в одиничних пацієнтів, а деякі не виявляють зовсім.
Серед обстежених дітей передбачалося отримати 81 комбінацію генотипів чотирьох досліджуваних генів, але 41 комбінація взагалі не була виявлена (білий колір), що може бути зумовлено невеликою вибіркою дослідження. Значущими виявилися 40 комбінацій генотипів, для 25 з них визначено підвищений ризик розвитку патології (темно-сірий колір), для 15 — низький ризик (світло-сірий колір) (див. рис. 2).
| Число генів у моделі | Комбінації генів у прогностичній моделі | Відтворюваність моделі | Точність моделі, % |
|---|---|---|---|
| 1 | ACE_I/D | 5/10 | 65,09 |
| 2 | MTRR_A66G/ACE_I/D | 6/10 | 71,47 |
| 3* | MTHFR_C677T/MTRR_A66G/ ACE_I/D | 10/10 | 81,19 |
| 4* | MTHFR_C677T/MTHFR_A1298C/ MTRR_A66G/ACE_I/D | 10/10 | 82,34 |
У табл. 3 наведено лише статистично достовірні комбінації поліморфних варіантів досліджуваних генів.
Встановлено зростання ризику розвитку IшIн у дітей:
- у 3,82 раза за наявності комбінації генотипів СT (C677T) та AС (A1298C) гена MTHFR;
- у 5,23 раза за наявності комбінації генотипу AC (A1298C) гена MTHFR та ID (I/D) гена ACE;
- у 5,31 раза за наявності комбінації генотипу GG (A66G) гена MTRR та ID (I/D) гена ACE (табл. 3).
Також впливовою стосовно розвитку ІшІн у дітей є наявність комбінації генотипів ТT (C677T) гена MTHFR та GG (A66G) гена MTRR, але у зв’язку з відсутністю у дітей контрольної групи цієї комбінації генотипів підрахунок СШ не проводили.
Відзначено суттєве зниження ризику розвитку IшIн у дітей:
- у 14,17 раза за наявності комбінацій генотипів CC (С677Т) та AA (1298С) гена MTHFR;
- у 11,15 раза за наявності комбінації генотипів CC (С677Т) гена MTHFR та AA (А66G) гена MTRR;
- у 12,22 раза за наявності комбінації генотипів CC (С677Т) гена MTHFR та II (I/D) гена ACE;
- у 7,59 раза за наявності комбінації генотипів AA (A1298C) гена MTHFR та AA (A66G) гена MTRR;
- у 5,30 раза за наявності комбінації генотипів AA (A1298C) гена MTHFR та II (I/D) гена ACE;
- у 6,77 раза за наявності комбінації генотипів AA (A66G) гена MTRR та II (I/D) гена ACE (див. табл. 3).
Виявлено також протекторний ефект комбінації генотипів CC/AA/AA/II за генами С677Т та А1298С гена MTHFR, A66G гена MTRR, I/D гена ACE: у контрольній групі було 10 (22,73%) дітей з подібним генотипом, водночас в основній групі не було жодного такого учасника.
Побудовано модель міжгенної взаємодії з підрахуванням їх потенціалів предикції (MDR 2.0). До побудови моделі залучили всі достовірні статистично значущі досліджувані гени, керуючись попередньо отриманими результатами щодо впливу цих генів на розвиток IшIн у дітей. Результати моделювання наведено у табл. 4.
Коефіцієнт перехресної перевірки був найвищим та визначив статистичну вірогідність для найкращих моделей, якими були три- та чотирикомпонентні моделі (див. табл. 4). Для них показано 100% відтворюваність (10/10) та високу точність прогнозування ризику розвитку ІшІн у дітей (>80%). Найвищу точність (82,34%) встановлено при моделі, що включала чотири гени — MTHFR (C677T)/MTHFR (A1298C)/MTRR (A66G)/ACE(I/D). Проведення додаткового коригуючого пермутаційного тесту (MDR.pt) підтвердило вірогідність отриманих нами результатів (p<0,05).
Висновки
1. Встановлено підвищення ризику розвитку ішемічних уражень головного мозку за наявності поліморфних варіантів СТ, ТТ за геном MTHFR, АС за геном MTHFR, GG за геном MTRR, DD за геном ACE та суттєве зростання ризику при їх комбінації.
2. Доведено вірогідне підвищення резистентності до розвитку IшIн у дітей з генотипом СС за геном MTHFR; генотипом AA за геном MTHFR; генотипом AA за геном MTRR та генотипом II за геном ACE.
3. Не виявлено статистично значущих відмінностей за генами FV (G1691A) та FII (G20210A) у дітей з IшIн та групи порівняння (p>0,05).
Список використаної літератури
- Смульська Н.О., Горовенко Н.Г., Зозуля І.С. та ін. (2013) Ішемічні інсульти у дітей: можливі причини та провокуючі фактори. Соврем. педиатрия, 1(49): 66–70.
- Arsene D., Găină G., Bălescu C., Ardeleanu C. (2011) C677T and A1298C methylenetetrahydropholate reductase (MTHFR) polymorphisms as factors involved in ischemic stroke. Rom. J. Morphol. Embryol., 52(4): 1203–1207.
- Chung Y., Lee S.Y., Elston R.C., Park T. (2007) Odds ratio based multifactor-dimensionality reduction method for detecting gene-gene interactions. Bioinformatics, 23(1): 71–76.
- Duran R., Biner B., Demir M. et al. (2005) Factor V Leiden mutation and other thrombophilia markers in childhood ischemic stroke. Clin. Appl. Thromb. Hemost., 11(1): 83–88.
- Herak D.C., Antolic M.R., Krleza J.L. et al. (2009) Inherited prothrombotic risk factors in children with stroke, transient ischemic attack, or migraine. Pediatrics, 123(4): e653–660.
- Kenet G., Lütkhoff L.K., Albisetti M. et al. (2010) Impact of thrombophilia on risk of arterial ischemic stroke or cerebral sinovenous thrombosis in neonates and children: a systematic review and meta-analysis of observational studies. Circulation, 121(16): 1838–1847.
- Panigrahi I., Chatterjee T., Biswas A. et al. (2006) Role of MTHFR C677T polymorphism in ischemic stroke. Neurol. India, 54(1): 48–50.
- Sucheston L., Chanda P., Zhang A. et al. (2010) Comparison of information-theoretic to statistical methods for gene-gene interactions in the presence of genetic heterogeneity. BMC Genomics, 11: 487.
- Zadro R., Herak D.C. (2012) Inherited prothrombotic risk factors in children with first ischemic stroke. Biochem. Med. (Zagreb), 22(3): 298–310.
Резюме. Ишемический инсульт — гетерогенное заболевание, на развитие которого влияет ряд генетических мутаций и этиологических факторов. Исследование роли полиморфных вариантов генов фолатного обмена — MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTRR (A66G), генов факторов свертывания крови — FV (G1691A), FII (G20210A), гена сердечно-сосудистого состояния — ACE (I/D), их комбинаций и межгенного взаимодействия в развитии ишемического инсульта у детей на сегодняшний день не проводилось. Установлено, что исследованные нами гены, кроме генов коагуляционных факторов FV (G1691A), FII (G20210A), влияют на развитие ишемического инсульта у детей. Определение склонности к развитию указанной патологии у детей позволит своевременно установить диагноз и назначить лечение.
Ключевые слова: полиморфизм, ген, ишемический инсульт, дети, межгенное взаимодействие.
Summary. Ischemic stroke is a heterogeneous disease, which development depends from genetic mutations and etiological factors. Study of the role of polymorphic variants of folate metabolism genes — MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTRR (A66G), genes of coagulation factors — FV (G1691A), FII (G20210A), gene of cardiovascular condition — ACE (I/D), their combinations and the gene-gene interaction in the development of ischemic stroke in children nowadays have not been conducted. We found, that studied genes except genes of coagulation factors FV (G1691A), FII (G20210A) affect the risk of ischemic stroke in children. Definition of predisposition to ischemic stroke in children allows to diagnose this pathology in time and begin treatment.
Key words: polymorphism, gene, ischemic stroke, children, gene-gene interaction.
Адреса для листування:
Смульська Наталія Омелянівна
04209, Київ, вул. Богатирська, 30
Київська міська дитяча клінічна лікарня № 1
E-mail: [email protected]
