Визначення ефективності магнітолазерного впливу на стан синтезу катехоламінів у культурі нейроклітин із гіпокампа

Вступ

Аналіз сучасних тенденцій розвитку терапевтичних технологій показує, що одним із важливих напрямків є розробка нових методів, спрямованих на зменшення «інвазивності, фармохімізму» та інших небажаних впливів на організм пацієнта, у тому числі лазерних методів. Переваги цих методів полягають у відсутності шкідливого іонізуючого випромінювання на організм пацієнта і відсутності протипоказань у більшості хворих, а також їхня неінвазивність, безконтактність, асептичність тощо. Тому ці методи визначають як «проривні технології», здатні в достатньо короткий період забезпечити перехід на новий рівень лікування хворих у різних галузях медицини (Барыбин В.Ф. и соавт., 2003).

Магнітолазерна терапія (МЛТ) — це поєднаний фізіотерапевтичний метод, в основі якого об’єднується одночасна дія магнітного поля та низькоінтенсивного лазерного випромінення різних параметрів із лікувально-профілактичною і реабілітаційною метою, що забезпечує сумарний лікувально-профілактичний і реабілітаційний ефект. Але слід підкреслити, що становлення МЛТ як одного з напрямків фізіо­терапії характеризується випереджаючим розвитком прикладних аспектів порівняно з теоретичним обґрунтуванням (Буйлин В.А., Москвин С.В., 2005; Москвин С.В., Буйлин В.А., 2006).

Дослідниками доведено, що органотипова культура нейронів із тканини мозку експериментальних тварин є повноцінною моделлю для дослідження впливу різноманітних чинників на синтез нейромедіаторів (Божкова В.П. и соавт., 1988; Gloveli T. еt al., 1997). На відміну від експериментів на тваринах in vivo, в яких результат зумовлений сумарною реакцією різних структур мозку, дослідження на культурах дозволяють дослідити окремі ланки цієї реакції, що надає вагому інформацію для поглибленого вивчення механізмів магнітолазерного впливу (МЛВ).

Мета дослідження — вивчення стану синтезу катехоламінів у культурі тканин з гіпокампа новонароджених щурів після МЛВ.

Об’єкт і методи дослідження

Робота виконана у відділі нейробіохімії ДУ «Інститут нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова НАМН України».

Методика культивування експлантатів із нервової тканини

Експлантаційні культури з нервової тканини новонароджених щурів отримані за загальноприйнятим методом (Божкова В.П. и соавт., 1988). У кожному експерименті використано по 16 щурів лінії Wistar, забитих методом цервікальної дислокації. Такий метод дозволяє зберегти морфологічну цілісність структур головного мозку, що є певною умовою для отримання ефективного росту культур. На проведення цього експерименту одержано дозвіл Комітету з біоетики ДУ «Інститут нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова НАМН України». Після розтину м’яких тканин голови та кісток черепа забитих тварин з поверхні мозку видаляли оболонки, вилучали мозок із порожнини черепа, промивали його у стерильному фізіологічному розчині, виділяли відповідні ділянки згідно з метою експерименту, які переносили у живильне середовище Ігла (Інститут поліомієліту і вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова, Росія). З вилучених ділянок мозкової тканини готували експлантати розміром 0,5–0,6 мм, які розміщували на адгезивні покривні скельця, попередньо вкриті розчином поліетиленіміну (1–3 мг/мл). Скельця з експлантатами переносили в чашки Петрі, у культиваційне живильне середовище стандартного складу: середовище Ігла, розчин Хенкса (Інститут поліомієліту і вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова, Росія) з додаванням 20% сироватки крові великої рогатої худоби (Конотопм’ясо, Україна). Культури утримували у вуглекислотному інкубаторі (УЛІ-20) при постійній температурі 37 °С, вологості 95% та вмісті СО₂ 5%. Культури щоденно прижиттєво спостерігали в інвертованому мікроскопі БИОЛАМ П-3, («Ленинградское оптико-механическое объединение», Росія). Заміну поживного середовища здійснювали через кожні 3 доби. У кожному досліді культивування експлантатів нервової тканини виконували у 16 чашках Петрі діаметром 3 см: 8 становили дослідну групу експлантантів, 8 — контрольну групу.

Через 5 діб культивування здійснювали 10 щоденних сеансів МЛВ на культури за допомогою апарата «КМІЛТА» (Росія), використовуючи інфрачервоне випромінювання (λ 0,89 мкм, Pімп. 7–8 Вт, частота ≤500 Гц) і магнітну індукцію (100 мТл). Енергетична доза за сеанс становила 1–2 Дж/см², що відповідає діапазону доз, які мають терапевтично-біостимулювальний ефект (Самосюк И.З. (ред.), 2004; Москвин С.В., Буйлин В.А., 2006). Для максимального наближення умов експерименту in vitro до клінічної практики МЛВ досліджували при проходженні через плоску кістку черепа.

Після закінчення досліду з кожної групи експлантантів забирали для мікроскопічного дослідження по 2 зразки культур, а інші культури нервових клітин використовували для визначення вмісту нейромедіаторів та білка. Концентрацію загального білка у зразках вимірювали за методом Лоурі з використанням реактиву Фоліна за допомогою спектрофотометра СФ-26 («Ленинградское оптико-механическое объединение», Росія) (Покровский А.Г. (ред.), 1969). Оскільки вимір маси культурального матеріалу може давати значну похибку, то інтенсивність флуоресценції в кожному зразку культур перераховували з урахуванням вмісту білка у ньому.

Гістофлуоресцентне виявлення катехоламінів у культивованих нейроклітинах гіпокампа

Культури фіксували на скельцях за допомогою 2% розчину гліоксилової кислоти (Janssen Chimica, Бельгія) і 1% розчину параформальдегіду (Janssen Chimica, Бельгія), що виготовлений на сольовому розчині буфера (NaCl 8 г, NaH₂PO₄ 0,5 г, KCl 0,2 г, NaHCO₃ 1 г, MgCl₂ 5 г, глюкоза 2 г, сахароза 6,6 г, H₂Odest до 1 л; рН 6,6–6,8). У цьому розчині фіксували інтактну та дослідну культуру (для мікроскопічного дослідженя) і додавали до гомогенату культурального матеріалу (1:1) для проведення кількісної реакції. Зразки культури фіксували в цьому буфері протягом 5–7 хв при температурі 2 °С. Продукт флуоресценції (3,4-дигідроізохінолін) утворювався в результаті реакції параформальдегіду із внутрішньоклітинними катехоламінами (і з дофаміном), а фіксуючий розчин буфера сприяв внутрішньоклітинному проникненню реагенту. Потім препарати культур висушували на теплому повітрі впродовж 20–25 хв та витримували при температурі 80 °С впродовж 5 хв для збудження флуоресценції (Луппа Х., 1980).

Отримані препарати культур досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопа (система IBAS-2000, Росія). Для кількісного виміру рівня флуоресценції нейроклітин після проведення реакції культуральний матеріал із кожного скельця окремо гомогенізували в буфері, що використовується для реакції Фалька — Хілларпа (Rochkind S. et al., 2002; Snyder S.K. et al., 2002) і дозволяє візуалізувати катехоламіни в цитоплазмі клітин за допомогою світлового флуоресцентного мікроскопа та вимірювати рівень флуоресценції за допомогою флуориметра КВАНТ (Росія). Флуоресценцію спостерігали в цитоплазмі клітин у вигляді гранул. Для кількісних вимірів із клітинного матеріалу виділяли розчинну форму шляхом його гомогенізації. Клітини із вмістом дофаміну виділяли із загальної флуоресценції катехоламінів за допомогою оптичних фільтрів. Максимум спектра збудження флуоресценції для катехоламінів становив 480–490 нм.

Результати та їх обговорення

Прижиттєві спостереження росту контрольних культур, отриманих із фрагментів гіпокампа мозку новонароджених щурів, показали, що на 14-ту добу культивування навколо експлантатів сформувалася досить поширена ділянка росту сіткоподібної структури. На оглядових гістологічних препаратах у клітинному складі культур спостерігали переважання нейробластів і нейроцитів із характерними фенотиповими ознаками. Гліальний компонент культур представлений моношаровими або сіткоподібними розростаннями астроцитів, серед яких розташовані нервові клітини.

На препаратах культур, забарвлених за методом Фалька — Хілларпа і досліджених у світловому флуоресцентному мікроскопі, в ділянці росту культур чітко візуалізуються катехолергічні нейрони завдяки інтенсивній флуоресценції продукту реакції.

Порівняльний аналіз особливостей гістофлуоресценції в катехолергічних ней­ронах у контрольних і дослідних культурах після МЛВ дозволив виявити суттєві якісні відмінності в характері внутрішньоклітинного розподілу продукту реакції та інтенсивності флуоресценції в нейронах цих груп культур.

По-перше, відзначено кількісно більший вміст катехоламінергічних нейронів у ділянці росту дослідних культур після МЛВ. У цих культурах катехоламінергічні нейрони виявляються не лише у центральних відділах, але й у периферичних зонах росту культур (рис. 1). На відміну від цього, у контрольних культурах катехоламінергічні нейрони менш чисельні й розміщені в основному на території експлантата і поблизу нього (рис. 2).

Рис. 1

Катехоламінергічні нейрони в культурі з гіпокампа мозку новонародженого щура. 14-та доба росту після МЛВ. Гістофлу­оресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х100

Рис. 2

Катехоламінергічні нейрони в контрольній культурі з гіпокампа мозку новонародженого щура. 14-та доба росту. Гістофлу­оресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х100

Важливо підкреслити також, що в контрольних культурах гранули катехоламінів спостерігали лише в перинуклеарній ділянці цитоплазми нейронів, на відміну від дослідних культур, де після МЛВ продукт реакції — гранули флуоресценції катехоламінів — щільно заповнюють цитоплазматичні тіла, зливаючись між собою (рис. 3).

Необхідно акцентувати увагу на те, що в дослідних культурах із гіпокампа після МЛВ ознаки високої концентрації катехоламінів виявляють також у відростках ней­ронів, що може відображати процес транс­порту медіаторів із цитоплазми вздовж відростків у напрямку синапсу (рис. 4). У контрольних культурах із гіпокампа гранул медіатора у відростках нейронів не виявлено.

Рис. 3

Катехоламінергічні нейрони в культурі з гіпокампа мозку новонародженого щура після МЛВ. 14-та доба росту. Гістофлу­оресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х400

Рис. 4

Катехоламінергічні нейрони в культурі з гіпокампа мозку новонародженого щура після МЛВ. 14-та доба росту. Гістофлу­оресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х400

Катехоламінергічні нейрони з високою інтенсивністю флуоресценції визначали також у складі нейритно-гліальних структур у ділянці росту дослідних культур (рис. 5).

Рис. 5

Катехоламінергічні нейрони у складі нейритно-­гліальних структур. Культура з тканини гіпокампа мозку новонародженого щура після МЛВ. 14-та доба росту. Гістофлуоресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х400

Важливо відзначити також наявність у ділянці росту дослідних культур після МЛВ попарно зближених катехоламінергічних нейронів, щільно заповнених гранулами — продуктом реакції на катехоламіни з початковими ознаками позаклітинної секреції (рис. 6). Саме в таких контактних ділянках можуть відбуватися реакції цитохімічного взаємообміну медіаторами між нейронами.

Рис. 6

Культура нейронів із гіпокампа новонародженого щура після МЛВ. 14-та доба росту. Попарно розташовані катехоламінергічні нейрони. Гістофлуоресцентне забарвлення за Фальком — Хілларпом. х400

Аналогічні результати МЛВ отримано в дослідженнях, максимально наближених до умов експерименту in vivo та до клінічної практики — при стимуляції через плоску кістку черепа.

Таким чином, за якісними цитоструктурними критеріями оцінки внутрішньоклітинного розподілу продукту реакції на катехоламіни в культивованих нейронах з гіпокампа мозку новонароджених щурів після МЛВ визначаються ознаки інтенсивнішого синтезу медіаторів порівняно з ней­ронами контрольних культур.

Факт стимулюючого МЛВ на активність синтезу катехоламінів у культивованих ней­ронах гіпокампа новонароджених щурів підтверджується результатами кількісного дослідження: спостерігається перевищення рівня цього показника в 1,2 раза відносно контролю (рис. 7).

Рис. 7

Інтенсивність сумарної флуоресценції катехоламінів у культурі нервових клітин із гіпокампа новонародженого щура. 14-та доба культивування. Реакція з параформальдегідом і гліоксиловою кислотою.

Експериментальне дослідження виконували в культурі, на ізольованій тканині, за відсутності зв’язків з іншими структурами мозку, тому отримане підвищення вмісту катехоламінів не може бути результатом перерозподілу між ними. Отже, за отриманими результатами, після МЛВ у дослідних культурах нейронів із гіпокампа мозку новонароджених щурів відбувається підвищення синтезу катехоламінів.

Висновки

1. МЛВ у біостимулювальній дозі (1–2 Дж/см²) не спричиняє негативних ефектів на цитоструктуру культивованих нейронів досліджених ділянок мозку новонароджених щурів.

2. Органотипова культура нервових клітин, отриманих із різних ділянок головного мозку експериментальних тварин, може бути використана як показова тестова система:

• для дослідження ефекту різних режимів МЛВ;
• для вивчення впливу на нейромедіаторний обмін при різних хворобах та лікуванні станів, що супроводжуються порушенням синтезу і транспорту нейромедіаторів для активації регенераційно-компенсаторних процесів, які забезпечують відновлення структури й функції синаптичного апарату ней­ронів.

Список використаної літератури

• Барыбин В.Ф., Жальников Д.В., Захарова И.А. (2003) Некоторые перспективные направления применения низкоинтенсивного лазерного излучения в диагностике и терапии. Альманах клин. медицины, 6: 191–207.
• Божкова В.П., Брежестовский Л.А, Буравлев В.М. и др. (1988) Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. Наука, Москва, 315 с.
• Буйлин В.А., Москвин С.В. (2005) Низкоинтенсивные лазеры в терапии различных заболеваний. Триада, Тверь, 173 с.
• Луппа Х. (1980) Основы гистохимии. Мир, Москва, 343 с.
• Москвин С.В., Буйлин В.А. (2006) Основы лазерной терапии. Триада, Москва, 251 с.
• Покровский А.Г. (ред.) (1969) Биохимические методы исследования в клинике. Медицина, Москва, 652 с.
• Самосюк И.З. (ред.) (2004) Физические методы в лечении и медицинской реабилитации больных и инвалидов. Здоров’я, Киев, 624 с.
• Gloveli T., Schmitz D., Heinemann U. (1997) Prolonged inhibitory potentials in layer III projection cells of the rat medial entorhinal cortex induced by synaptic stimulation in vitro. Neuroscience, 80(1): 119–131.
• Rochkind S., Shahar A., Amon M., Nevo Z. (2002) Transplantation of embryonal spinal cord nerve cells cultured on biodegradable microcarriers followed by low power laser irradiation for the treatment of traumatic paraplegia in rats. Neurol. Res., 24(4): 355–360.
• Snyder S.K., Byrnes K.R., Borke R.C. et al. (2002) Quantitation of calcitonin gene-related peptide mRNA and neuronal cell death in facial motor nuclei following axotomy and 633 nm low power laser treatment. Lasers Surg. Med., 31(3): 216–222.

Адреса для листування:
Зубкова Олена Вікторівна
04050, Київ, вул. Платона Майбороди, 32
ДУ «Інститут нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова НАМН України»