Оценка влияния комбинированного орального контрацептива Линдинет 20 на механизмы регуляции пролиферативных процессов при эндометриоидной болезни

Введение

Эндометриоз относится к числу наиболее распространенных гинекологических заболеваний у женщин репродуктивного возраста, приводящих к существенному нарушению качества жизни и снижению фертильности. При этом проблема этиологии, патогенеза и, соответственно, подходов к лечению данного заболевания остается открытым вопросом для дискуссий (Адамян Л.В., Андреева Е.Н., 2001; Баскаков В.П. и соавт., 2002; Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005; Адамян Л.В. и соавт., 2006; Линде В.А., Татарова Н.А., 2010).

С современных позиций эндометриоз — эстрогензависимое доброкачественное пролиферативное заболевание, при котором за пределами границ нормального расположения слизистой оболочки матки происходит разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам идентичной эндометрию («эндометриоидные очаги», «эндометриоидные эктопии», «эндометриоидные гетеротопии») и сопровождающейся локальной воспалительной реакцией, гиперэстрогенемией, усиленным ангиогенезом, иммуносупрессией и дисбалансом в системе про- и антиапоптических сигналов в клетках эктопического эндометрия, их выраженным инвазивным и пролиферативным потенциалом (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005; Потапов В.А. и соавт., 2008). Эндометриоз следует рассматривать как длительно текущее заболевание, требующее планового лечения в течение всей жизни, цель которого — достичь максимального эффекта от медикаментозной терапии и избежать повторных операций (Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine, 2008).

Эндокринная зависимость эндометриоидных гетеротопий не вызывает сомнений, поэтому гормональная терапия занимает ведущее место в консервативном лечении эндометриоидной болезни, при неэффективности которой рекомендовано оперативное лечение с последующей медикаментозной поддержкой как для профилактики рецидивов заболевания, так и при неполной эрадикации очага эктопии (Баскаков В.П. и соавт., 2002). В последнее время консервативные и хирургические методы рассматривают не как альтернативные подходы, а этапы одной стратегии лечения эндометриоза (Адамян Л.В. и соавт., 2006).

Среди консервативных методов лечения эндометриоза обычно применяют различные группы гормональных препаратов, позволяющие достичь состояния гипоэстрогении, способствующей обратному развитию и уменьшению размеров эндометриоидных гетеротопий. Основными фармакологическими эффектами этих препаратов являются торможение выделения гонадотропных гормонов гипофиза и подавление функции яичников (агонисты гонадотропин-рилизинг-гормонов (ГнРГ), антигонадотропины), умеренное антигонадотропное влияние и периферическая деградация эстрогеновых рецепторов (гестагены и комбинированные оральные контрацептивы (КОК)), блокада внегонадной локальной конверсии андрогенов в эстрогены (ингибиторы ароматазы) (Бас­каков В.П. и соавт., 2002; Адамян Л.В. и соавт., 2006).

Несмотря на разногласия экспертов, на данном этапе агонисты ГнРГ являются своего рода золотым стандартом в лечении эндометриоза, хотя препараты этой группы имеют ограничения по длительности применения (до 6 мес) из-за риска развития остеопороза (Баскаков В.П. и соавт., 2002; Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005; Адамян Л.В. и соавт., 2006). Доказано воздействие агонистов ГнРГ на факторы роста, пролиферативный потенциал, апоптоз и ангиогенез (Адамян Л.В. и соавт., 2006). Следует признать, что доказательная база в отношении антипролиферативного эффекта различных гестагенов и КОК, несмотря на все более широкое их позиционирование с целью лечения эндометриоза (Міністерство охорони здоров’я України, 2003), на сегодняшний день недостаточна. В 4 систематических обзорах показана одинаковая эффективность постоянного (в течение 6 мес) применения даназола, гестринона, медроксипрогестерона, КОК, аналогов гонадолиберина в сравнении с плацебо в купировании болевого синдрома при эндометриозе (Потапов В.А. и соавт., 2008). Существуют опасения, что эстрогены в составе КОК могут оказывать нежелательное противоположное влияние (Sinaii N. et al., 2007). Данные литературы об эффективности медикаментозной терапии иногда могут ввести в заблуждение при выборе формы гормонального лечения с учетом того, что ни один из известных сегодня препаратов не устраняет морфологический субстрат эндометриоза, а лишь оказывает опосредованное влияние на него, чем и объясняется симптоматический клинический эффект.

Учитывая то, что истинные механизмы, регулирующие процессы имплантации и развития эндометриоидных гетеротопий сложны и недостаточно изучены, существующая практика оценки терапевтичес­кой эффективности лекарственных препаратов, применяемых при эндометриоидной болезни в основном базируется на динамике характерных для данной патологии клинических критериев (болевой синдром), аппаратно-визуальных (ультразвуковое исследование (УЗИ), компьютерная томография, магнитно-резонансная томография — МРТ) и эндоскопических признаков манифестации болезни, результатах серологических тестов (биохимичес­кие и иммунологические показатели, уровни стероидных гормонов и онкомаркеров), которые не являются патогномоничными в отношении механизмов клеточной пролиферации, носят неспецифичес­кий или субъективный характер с высокой вариабельностью признаков. Разработка и все более широкое внедрение в медицину молекулярных технологий и методов иммуногистохимичес­кого (ИГХ)-исследования митотической активности и генетически детерминированных ростовых факторов в различных тканях открывают хорошую перспективу не только для расширения знаний об эндометриоидной болезни в целом, но и объективизации и стандартизации терапевтической стратегии, основанной на строгих закономерностях цитоиммунофенотипа эндометриоидных гетеротопий. С этих позиций особенно актуальным становится переоценка существующих и поиск новых подходов к оптимизации гормональной терапии эндометриоза с направленной антиэстрогенной активностью и минимальными побочными эффектами при длительном применении.

Цель проведенного нами исследования — оценка супрессорного влияния монофазного микродозированного КОК Линдинет 20 («Richter Gedeon»), содержащего этинилэстрадиола 0,02 мг и гестодена 0,075 мг, на пролиферативную функцию эндометриальных желез и стромы у женщин с эндометриозом ретроцервикальной локализации.

Обоснованием выбора данного КОК, кроме низкого содержания эстрогенного компонента, послужило наличие в его составе производного нортестостерона последнего поколения — гестодена, который занимает одну из лидирующих позиций по антипролиферативной активности в линейке современных гестагенов и имеет практически 100% биодоступность. Гестоден обладает выраженными антиэстрогенными свойствами в клетках эндометрия, нейтрализуя нежелательные метаболичес­кие эффекты, и небольшой андрогеноподобной активностью, однако в комбинации с этинилэстрадиолом оказывает антиандрогенное действие за счет индукции синтеза глобулинов, связывающих половые стероиды, и ингибирования выработки гонадотропных гормонов, стимулирующих синтез андрогенов в яичниках. Кроме этого, за счет антиминералокортикоидного действия при приеме гестодена отсутствуют напряжение молочных желез, головная боль (Міністерство охорони здоров’я України, 2003).

Объект и методы исследования

Проведено сравнительное морфо- и ИГХ-исследование операционных образцов тканей 68 больных репродуктивного возраста (31,6±6,4 года) с эндометриозом ретроцервикальной локализации I–III степени распространения по классификации Л.В. Адамян и соавторов (2006), которым в течение 6 мес перед операцией проведено гормональное лечение.

Больных рандомизировали случайным образом на три группы. В 1-ю группу во­шли 26 пациентов, применявших в пролонгированном режиме (без перерывов на менструальноподобную реакцию) микродозированный КОК Линдинет 20. Во 2-ю группу включены 18 пациентов, применявших аналог ГнРГ гозерелин в дозе 3,6 мг/мес. Гозерелин выбран препаратом сравнения, поскольку относится к группе препаратов, признаных стандартом медикаментозной терапии эндометриоза. Контрольную группу составили 24 женщины, которым адъювантную терапию перед операцией не проводили, а операция проведена в конце 1-й фазы менструального цикла, когда, как известно, эстрогенная стимуляция органов-­мишеней максимальна.

Гормональное лечение применяли с целью уменьшения объема гетеротопий, интраоперационной кровопотери и травматизации окружающих тканей, а также облегчения симптомов заболевания в тех случаях, когда выполнение операции по разным причинам было отсрочено.

Показаниями к проведению операции были выраженная тазовая боль и диспареуния на почве эндометриоза ретроцервикальной локализации, диагностированного на основании характерной клинической симптоматики и данных гинекологического обследования, результатов УЗИ, МРТ, а также диагностической лапароскопии по поводу перитонеального бесплодия.

Биопсию образцов тканей в ходе операции брали из очагов эктопии эндометрия до их деструкции (иссечение или абляция) и из макроскопически неповрежденных участков брюшного покрова и подлежащих тканей вблизи очага (эутопические ткани).

Для проведения ИГХ-исследования операционный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина на протяжении 10–12 ч с последующей проводкой и заливкой в парафин, согласно принятым стандартам. Парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм, полученные на микротоме марки «Microm HM 340», наносили на специально обработанные адгезивные предметные стекла SuperFrost Plus и депарафинировали с последующим проведением тепловой индукции путем нагревания в автоклаве в течение 8 мин при температуре 121 °С в цитратном буфере с рН 6,0.

В основе прогрессирования эндометриоидных гетеротопий, как и какого-либо другого гиперпролиферативного процесса в репродуктивной системе, лежит соотношение процессов пролиферации, апоптоза, синтеза ростовых факторов, уровня гормональных промоторов сигнальных путей пролиферативных каскадов и чувствительность к ним рецепторного аппарата. В связи с этим в исследовании проведена оценка следующих основных ИГХ клеточных маркеров пролиферативных каскадов: маркера клеточной пролиферации Ki-67 (клон MIB-1 (Dako), SP6 (LabVision)), фактора роста ендотелия сосудов (vаscular endothelial growth factor — VEGF) (клон VG1 (Dako), Bcl-2 (клон 124 (Dako)), рецепторов эстрогена (estrogen receptor — ER) (клон 1D5 (Dako), SP1 (LabVision)) и прогестерона (progesterone receptor — PR) (клон PgR 636 (Dako), SP2 (LabVision)), маркера ингибитора апоптоза Bcl-2 (клон 124 (Dako)), а также маркера эндотелиальных клеток сосудов CD34 (клон QBEnd (Dako)).

В основе ИГХ-исследования лежит специфическое взаимодействие между поликлональными или моноклональными антителами и антигенными детерминантами тканей с последующей визуализацией реакции на светооптическом уровне. Титр антител подбирали индивидуально для каждого маркера с использованием в качестве растворителя специального раствора Antibody Diluent (DakoCytomation). Вторичные антитела, которые содержали большое количество молекул пероксидазы хрена, наносили на срезы и инкубировали во влажных камерах на протяжении 30 мин с промыванием в трис-буферном растворе между каждым этапом в течение 10 мин. Идентификацию реакции проводили путем нанесения хромогена (DakoCytomation) под контролем микроскопа на протяжении от 20 с до 3 мин с проявлением в виде темно-коричневого окрашивания специфических структур в зависимости от маркера (интрануклеарная, цитоплазматичес­кая, мембранная реакции). Для дифференцирования структур тканей срезы дополнительно окрашивали гематоксилином Майера в течение 1–3 мин. Последующую их дегидратацию и заключение в бальзам осуществляли в соответствии с общепринятым стандартом.

Количественные и качественные показатели экспрессии маркеров изучали при микроскопии гистологических срезов как минимум на 8–10 случайно выбранных полях зрения при увеличении в 100; 200; 400 и 1000 раз с использованием микроскопа «Leica» (Германия).

Для оценки ИГХ-реакции использовали полуколичественный компьютерный анализ цифровых изображений (Semi-quantitative digital image analysis) плагинами «Colour Deconvolution» и «Cell Counter», которые позволяют выделить 10 полей по 100 клеток в разных областях микропрепарата и подсчитать количество окрашенных ядер и индексы экспрессии маркеров с интрануклеарной окраской. Цифровые изображения TIFF-формата (в каждом срезе — 10 репрезентативних зон) получали с помощью фотокамеры «Canon EOS D30» (ручной режим фотографирования A/N/M: светочувствительность ISO-100, экспозиция 1/15 с, диафрагма 1,6 мм).

Для максимальной точности количественной оценки изучаемых ИГХ-маркеров подсчитывали уровень их експрессии не менее чем в 1000 клеток. Для определения среднего значения (Н-индекса) ER, PR оценивали только интрануклеарные реакции в клетках не менее как в 10 полях зрения при увеличении в 400 раз. При анализе учитывали количество прореагировавших клеточных ядер, а также интенсивность окрашивания, которая варьирует в пределах 0–3 баллов (0 — отсутствие интрануклеарного окрашивания (негативная реакция), 1 — слабопозитивная, 2 — умеренновыраженная, 3 — интенсивная равномерная внутриядерная реакция. Средние значения (Н-индекс) рассчитывали полуколичественным методом по формуле:

Н = (доля (%) слабопрореагировавших клеток · 1) + (доля (%) клеток с умеренновыраженной реакцией · 2) + (доля (%) клеток с интенсивной реакцией · 3).

Показатели 0–50 баллов расценивали как отсутствие экспрессии, 50–100 — как слабопозитивную, ≥100 баллов — как позитивную экспрессию антигенов к рецепторам.

Индекс пролиферации Ki-67 высчитывали как процент клеток с позитивной интрануклеарной реакцией (антигенные детерминанты расположены в ядре) от общего среднего количества клеток при изучении всех участков.

При анализе ИГХ-окрашивания с VEGF использовали следующие критерии в баллах: 0 — негативная реакция (отсутствие какой-либо позитивно окрашенной клетки), 1 — слабоокрашено (позитивно окрашены дискретно расположенные клетки), 2 — умеренновыраженное окрашивание (большое количество позитивноокрашенных клеток), 3 — интенсивное мембранное и/или цитоплазматическое окрашивание.

Расчет протеинов Bcl-2 проводили согласно рекомендациям D. Dixon и соавторами (2002) по следующей балльной шкале: 0 — отсутствие реакции (негативная), 1 — слабопозитивная реакция (1–25% клеток позитивноокрашены), 2 — умеренно выраженная позитивная реакция (26–50%), 3 — интенсивная реакция (51–75%), 4 — очень интенсивная цитоплазматическая и/или мембранная реакция (76–100%).

Подсчет плотности микрососудов в CD34-позитивных структурах проводили при увеличении в 200 раз (площадь поля зрения — 0,74 мм²). Результаты отображали как среднее количество сосудов в 5 наиболее васкуляризованных полях зрения.

Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента, а также расчета интенсивных и экстенсивных показателей.

Результаты и их обсуждение

Антитело Ki-67 позволяет идентифицировать ядерный антиген, который экспрессируется во всех клетках, вышедших из G0 фазы митоза, то есть дает возможность оценить пролиферативный потенциал клеток образца ткани. В контрольной группе больных, не получавших гормонального лечения, экспрессия Кi-67 выявлена как в железистом эпителии, так и в стромальных клетках практически во всех биоптатах тканей из очагов эндометриоза. Как продемонстрировано на рис. 1, в целом для образцов тканей эктопического эндометрия была характерна более высокая (в 4,5 раза) пролиферативная активность в сравнении с образцами эутопичес­ких тканей (р<0,01).

Рис. 1

Динамика ИГХ-маркеров пролиферации и ангиогенеза в эндометриоидных гетеротопиях (в % по отношению к аналогичным показателям эутопических тканей, принятых за 100%)

Причиной повышенной пролиферации эндометриальных клеток могут быть выявленные нами нарушения в регуляции их апоптоза и избыточная экспрессия ядерных рецепторов к эстрогенам (ER), являющихся важным звеном гормонозависимых сигнальных путей пролиферативных каскадов.

Апоптоз представляет собой биологический механизм поддержания клеточного гомеостаза посредством уничтожения ненужных или избыточно пролиферирующих в физиологических условиях клеток с их последующей элиминацией из организма. Циклический рост, или так называемый тканевой ремоделинг, отмечаемый в репродуктивный период, представляет собой в сущности этапы планирования программирования клеточной гибели. Апоптоз, наблюдаемый в процессе секреторной и менструальной фаз цикла, является ключевым событием, регулирующим количество клеток нормально расположенного эндометрия. Индукция апоптоза происходит без вовлечения иммунных реакций или воспаления и требует активной экспрессии генов (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005).

Ключевой механизм апоптоза — регулирование распада ДНК с участием белков семейства Bcl-2 (В-клеточная лимфома/лейкемия 2), которые первоначально изучены на клетках лимфом (отсюда и название) и к настоящему времени наиболее исследованы. Ген Bcl-2 (регулятор смерти) является протоонкогеном, локализующимся в хромосомах человека и кодирующим одноименный белок, расположенный на внутренней мембране митохондрий (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005). Гиперэкс­прессия Bcl-2 несет антиапоптотический потенциал в клетке и защищает ее от гибели (апоптическая устойчивость).

Накопление онкопротеина Bcl-2 отмечено нами как в цитоплазме железистого эпителия, так и в стромальных клетках, при этом его экспрессия в очагах эктопического эндометрия в 1,8 раза превышала аналогичный показатель в эутопических тканях (см. рис. 1). По-видимому, избыток экспрессии Всl-2 препятствует восстановлению баланса в про- и антиоапоптических сигнальных путях (и, таким образом, формирует основу для выживания эктопичес­ких эндометриальных клеток) и их аномальному накоплению в очагах эндометрио­за, что способствует прогрессированию заболевания.

Известно, что на клеточном уровне процессы пролиферации и апоптоза в репродуктивной системе индуцируют половые гормоны с участием генов и протоонкогенов. При этом степень экспрессии ER определяет ответ клетки на эстрогены, которые вовлечены во множество пролиферативных каскадов, в том числе развитие и рост эндометриоидных гетеротопий (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005).

Способность эдометриальных имплантов сохранять гормональные ответы доказана еще в конце XX ст. (Dizerega G.S. et al., 1980) при изучении влияния эстрогенов, прогестерона и плацебо на рост перитонеальных эндометриальных имплантов у кастрированых обезьян. Эстрогены были способны поддерживать рост эндометриальной ткани на брюшине, при гипоэстрогении наблюдали атрофию ткани эндометрия. Это послужило основанием для формирования гипотезы, что именно гормональные ответы эндометриальной ткани формируют физиологичес­кую основу для эффективной супрессорной гормональной терапии.

Следует отметить (см. рис. 1), что экспрессия ядерных рецепторов к эстрогенам в ИГХ-позитивных клетках эпителия и стромы эндометриальных гетеротопий и эндометрии женщин контрольной группы, не получавших гормональное лечение, существенно не различались (р<0,1). Однако в сравнении с аналогичными исследованиями в эутопических участках брюшины ретроцервикальной области экспрессия их в очагах эндометриоза была в 3,8 раза выше, что свидетельствует о более высоком потенциале колонизации подобных эндометрию клеток в зоне инвазии за счет высокой плотности ядерных гормон-рецепторных комплексов, запускающих механизмы транскрипции эстроген-зависимых генов, результатом которой является цитопролиферативная активность. Это обстоятельство дало нам основание провести сравнительную оценку экспрессии ростовых факторов в очагах эндометриоза и расположенных рядом эутопических тканях, считая, что именно этот критерий на границе «поражение — здоровая ткань» в значительно большей степени характеризует пролиферативный потенциал зоны эктопии эндометрия и способность к прогрессу заболевания, чем сравнение с нормально расположенным эндометрием в полости матки.

Исследование тканей биоптатов из очагов эндометриоза с использованием антител к рецептору CD34 — маркеру клеток эндотелия сосудов — позволило визуализировать сосуды и оценить уровень ангиогенеза. В контрольной группе пациентов с эндометриозом ретроцервикальной локализации, не получавших гормональное лечение, распределение сосудов в исследованных биоптатах было неравномерным и зависело от пролиферативной активности эктопии. Вокруг неактивных зон (отсутствие экспрессии Ki-67) в очагах склероза сосудов их или практичес­ки не было, или, наоборот, из-за коллапса стромы они были сближены. Только вокруг участков активного эндометриоза (позитивная экспрессия Ki-67) отмечена высокая выявляемость CD34, свидетельствующая о повышенном ангио­генезе.

Количественная оценка плотности гемокапилляров при ИГХ-исследовании CD34 показала, что в целом в очагах эндометриоза плотность сосудов в сравнении с эутопическими тканями была в 2,1 раза выше (р<0,05). Плотность сосудов была выше в материале, полученном из обширных очагов эндометриоза, чем в препаратах из небольших участков поражения, что свидетельствует о том, что прогресс заболевания возможен только при наличии адекватного кровоснабжения с формированием зоны активного эктопического роста эндометриальных клеток.

В регуляции ангиогенеза участвует ряд биологических веществ. Главным общепризнанным индуктором ангиогенеза является VEGF, который индуцирует пролиферацию клеток эндотелия и важен для заживления ран, роста опухоли и метастазирования. Высокая экспрессия VEGF в эктопическом эндометрии, по-видимому, является одним из условий успешной имплантации и прогрессирования эндометриоза (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005).

Нами выявлена высокая экспрессия VEGF не только в зоне эктопии эндометрия, но и на периферии очага с эутопическими тканями, где этот показатель оказался повышенным почти в 4 раза (рис. 2). Это свидетельствует о более высоком потенциале к росту эктопического эндометрия именно на периферии очага, что объясняет феномен инвазии эндометриоидных очагов вглубь тканей, в котором, по-видимому, участвуют не только клетки-импланты, но и клетки-реципиенты.

Известно, что экспрессия VEGF увеличивается при гипоксии, наблюдается также накопление VEGF клетками, вовлеченными в воспаление (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005). Очевидно, что деструкция и «микроменструация» клеток-имплантов эндометрия на эктопированных участках с развитием воспаления в окружающих тканях постоянно поддерживает активный ангиогенез вблизи границ эктопии.

Таким образом, как показало проведенное нами исследование, для иммунофенотипа ретроцервикального эндометриоза характерны высокая экспрессия ER, ингибитора апоптоза протоонкогена Bcl-2, ростового фактора VEGF и повышенный ангиогенез не только в очагах эктопического эндометрия, но и в пограничных зонах эутопических тканей, которые, по- видимому, играют важную роль в патогенезе эндометриоидной болезни.

Супрессивное гормональное лечение, проведенное в течение 6 мес у пациенток 1-й и 2-й групп внесло существенную коррекцию в большинство изученных нами ИГХ-маркеров пролиферации. Так, у пациенток 1-й группы, принимавших с целью лечения эндометриоза КОК, отмечено снижение пролиферативной активности в зонах эктопического миометрия на 51,1% (рис. 2), что не намного уступало этому показателю во 2-й группе пациентов с депривацией яичникового стероидогенеза, вызванной агонистом ГнРГ, где редукция экспрессии Ki-67 составила в среднем 60% по отношению к контрольной группе. Однако (см. рис. 2), полного угнетения митотической функции клеток в эндометриоидных очагах ни в одном случае не зарегистрировано, разве что в половине случаев экспрессия Ki-67, как в 1-й, так и 2-й группе, приблизилась к этому показателю в эутопических тканях этих же пациентов. Таким образом, можно сделать вывод, что антиэстрогенное медикаментозное лечение воздействует только на гормонозависимый сигнальный путь регуляции пролиферации, который, как известно, является не единственным.

После гормонального лечения с применением КОК у пациентов 1-й группы экспрессия гена Bcl-2 снизилась на 36,1% по отношению к контрольной группе и практически достигла уровня апоптоза в эутопических тканях (рис. 2), что свидетельствует о гормонозависимости этого процесса в репродуктивных органах. Очевидно, что один из позитивных моментов приема КОК — это усиление программированной клеточной смерти и уменьшение роста эктопического эндометрия. Аналогичная тенденция отмечена и при применении в лечении эндометриоза агониста ГнРГ (см. рис. 2).

Рис. 2

Динамика ИГХ-маркеров пролиферации и ангиогенеза в эндометриоидных гетеротопиях после 6 мес гормонотерапии КОК (Линдинет 20) и гозерелином (в % по отношению к аналогичным показателям эутопических тканей, принятым за 100%)

Считается, что синтез ER регулируется соответствующим гормоном (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005), поэтому на фоне применения агониста ГнРГ и достигнутой выраженной гипоэстрогении, что сопровож­далось аменореей у больных 2-й группы, можно было ожидать уменьшения экспрессии ER в эндометриоидных очагах. Вопреки ожиданиям, снижения экспрессии ER в исследованных морфологических образцах тканей не наблюдали, и этот показатель, как и в контрольной группе больных, у которых не проводили гормонального лечения, почти в 4 раза превышал уровень экспрессии ER в эутопических тканях. Таким образом, центральное торможение стероидогенеза в яичниках не отразилось на экспрессии ER, что можно объяснить только наличием локальных условий для стимуляции рецепторного аппарата непосредственно в тканях эндометриоидных гетеротопий.

K. Zeitoun и соавторами (1998) показано, что значительные изменения фермента ароматазы — представителя надсемейства цитохромов Р450 19 семейства — в стромальных клетках при эндометриозе вызывают в этой ткани конверсию андростендиола в эстрон, являющийся слабым эстрогеном, но способным к преобразованию в 17-β-эстрадиол в процессе катализации с участием фермента 17-β-гидрокси­стероиддегидрогеназы типа 1. Высокая вероятность локального стероидогенеза в какой-то степени объясняет выявленную нами сохранность высокой экспрессии рецепторов половых гормонов с потенцией к эстрогенной стимуляции в эндометриоидных очагах сразу после окончания лечения агонистом ГнРГ, хотя требует проверки — достаточно ли того количества конверсированного эстрогена для гипер­экспрессии ядерного рецепторного аппарата. Вместе с тем, проведенные исследования полностью подтверждают тезис, что эффект лечения эндометриоза при применении агонистов ГнРГ наблюдается только в процессе лечения, а после его окончания быстро нивелируется, и не менее чем у 78% больных после отмены медикаментозной терапии отмечается персистенция заболевания (Баскаков В.П. и соавт., 2002; Адамян Л.В. и соавт., 2006). Но, в отличие от авторов, считающих, что чувствительность рецепторов стероидных гормонов в эктопичес­ких очагах снижена или изменена, что может проявляться резистентностью эндометриоза к действию гормональных препаратов, по нашему мнению, вытекающему из проведенного исследования, недостаточная эффективность супрессивной гормональной терапии, в частности аналогами ГнРГ, объяснима как раз высокой сохранностью рецепторного аппарата, обусловленного локальным стероидогенезом и быстрым возобновлением процесса гиперпролиферации эндометриальных имплантов после окончания лечения и восстановления стероидогенеза в яичниках.

В противоволожность вышеотмеченному явлению, в 1-й группе пациентов, получавших КОК, наблюдалось снижение экспрессии эстрогеновых рецепторов в 2 раза в сравнении с контрольной группой, то есть очевидное снижение активности рецепторного аппарата. Механизм этого явления прогнозируем. Как известно, гестагены, как в чистом виде, так и в сос­таве КОК, вызывают деградацию ER, и в этом заключается их главный супрессивный эффект при гиперпролиферативных процессах в репродуктивных органах. Кроме того, прогестерон стимулирует инактивацию 17-β-эстрадиола с преобразованием его в малоактивный эстрон под каталитическим действием 17-β-гидро­ксистероиддегидрогеназы типа 2. В пользу супрессивного эффекта гестагенов свитедельствует тот факт, что эндометриоз в значительной степени снижает свою активность в период беременности и вновь обостряется в послеродовой период и после аборта (Баскаков В.П. и соавт., 2002).

После 6 мес терапии КОК у пациенток 1-й группы выявлено снижение экспрессии маркеров ангиогенеза CD34 на 28,6% и VEGF — на 48,7% по сравнению к конт­рольной группой (см. рис. 2). Для сравнения во 2-й группе больных на фоне медикаментозной менопаузы, вызванной гозерелином, снижение плотности сосудов микроциркуляторного русла по результатам оценки CD34 и продукции VEGF в зоне эндометриальной эктопии было более выражено (снижение экспрессии указанных маркеров на 42,9 и 62,5% соответственно). Пока неясно, является ли обструкция микроциркуляции следствием опосредованного влияния гормональной терапии на ростовой фактор VEGF или результатом снижения общей митотической активности и регресса массы эктопического эндометрия, но результат во всех случаях был однозначный — локальная редукция кровоснабжения сопровождалась уменьшением количества Ki-67-позитив­ных клеток и клиническим уменьшением очага поражения. В этой связи очевидно, что процесс деваскуляризации прямо пропорционален экспозиции гормональной терапии, и в этом отношении КОК имеют перед аналогами ГнРГ преимущество, которое заключается в возможности проведения более длительного курса терапии (≥12 мес).

Выводы

По данным проведенного ИГХ-исследования маркеров пролиферации, супрессивный эффект микродозированного КОК Линдинет 20 (этинилэстрадиола 0,02 мг и гестодена 0,075 мг) при применении в непрерывном режиме в соответствии с клиническим протоколом лечения генитального эндометриоза (Міністерство охорони здоров’я України, 2003) не уступает по ряду позиций агонисту ГнРГ гозерелину, а, следовательно, указанный КОК может быть успешно применен в терапии эндометриоидной болезни как самостоятельно, так и в сочетании с оперативным лечением.

Отметим, что исследование маркеров пролиферации, ангиогенеза, апоптоза и рецепторов стероидных гормонов не только играет важную роль в понимании процессов имплантации и прогрессирования эндометриоидных гетеротопий на уровне ауто-, интра- и паракринной регуляции, но и дает возможность получить молекулярные доказательства эффективности разных методов гормональной супрессивной терапии эндометриоза.

Список использованной литературы

• Адамян Л.В., Андреева Е.Н. (2001) Генитальный эндометриоз. Этиопатогенез, клиника, диагностика, лечение. Метод. пособие для врачей. Медицина, Москва, 35 с.
• Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андре­ева Е.Н. (2006) Эндометриозы: Руководство для врачей. Медицина, Москва, 416 с.
• Баскаков В.П., Цвелев Ю.В., Кира Е.Ф. (2002) Эндометриоидная болезнь. Издательство Н–Л, Санкт-Петербург, 452 с.
• Киселев В.И., Ляшенко А.А. (2005) Молекулярные механизмы регуляции гиперпластических процессов. Димитрейд График Групп, Москва, 348 с.
• Линде В.А., Татарова Н.А. (2010) Эндометриозы. Патогенез, клиническая картина, диагностика и лечение. ГЭОТАР-Медиа, Москва, 192 с.
• 
  Міністерство охорони здоров’я України (2003) Наказ Міністерства охорони здоров’я України від 15.3 грн. № 582 «Про затвердження клінічних протоколів з акушерської та гінекологічної допомоги» (http://www.moz.gov.ua/ua/portal/dn_20031215_582.html).
• Потапов В.А., Медведев М.В., Ивах В.И. (2008) Комментарии к клинической оценке непрерывного режима использования микродозированного комбинированного орального контрацептива Линдинет-20 в целях профилактики послеоперационных рецидивов эндометриомы яичников у женщин репродуктивного возраста. Здоровье женщины, 3(1): 136–139.
• Dixon D., Flake G.P., Moore A.B. et al. (2002) Cell proliferation and apoptosis in human uterine leiomyomas and myometria. Virchows. Arch., 441(1): 53–62.
• Dizerega G.S., Barber D.L., Hodgen G.D. (1980) Endometriosis: role of ovarian steroids in initiation, maintenance, and suppression. Fertil. Steril., 33(6): 649–653.
• Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine (2008) Treatment of pelvic pain associated with endometriosis. Fertil. Steril., 90(5 Suppl.): S260– S269.
• Sinaii N., Cleary S.D., Younes N. et al. (2007) Treatment utilization for endometriosis symptoms: a cross-sectional survey study of lifetime experience. Fertil. Steril., 87(6): 1277–1286.
• Zeitoun K., Takayama K., Sasano H. et al. (1998) Deficient 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression in endometriosis: failure to metabolize 17beta-estradiol. J. Clin. Endocrinol. Metab., 83(12): 4474–4480.