Особливості імунного статусу пацієнтів із запальними захворюваннями очей герпесвірусної етіології

Вступ

Патогенетично рецидивуючі запальні захворювання очей (ЗЗО) герпесвірусної етіології — імуноопосередковані вірус-індуковані запальні процеси у тканинах ока, що характеризуються неухильно прогресуючим і рецидивуючим перебігом із подальшим розвитком тяжких інвалідизуючих ускладнень. Тому ідентифікація ролі різних вірусів родини герпесу в розвитку ЗЗО, вивчення імунних механізмів ураження тканин ока та механізмів підтримання рецидивів захворювання є одним із перспективних напрямків сучасної офтальмології та імунології. З цією метою здійснюють пошук нових орієнтирів, за якими можна було б прогнозувати перебіг офтальмогерпесу, а виходячи з цього — вчасно застосовувати адекватну протирецидивну терапію (Гранитов В.М., 2001; Драннік Г.М. (ред.), 2006; Казмірчук В.Є., Ковальчук Л.В., 2006).

Оскільки залишається багато питань у розумінні взаємодії вірусів родини герпесу та механізмів імунологічної відповіді на інфекцію актуальним є всебічне вивчення імунного статусу хворих на рецидивуючі форми герпесвірусних інфекцій, а також розробка та застосування нових методів імунотерапії ЗЗО із дослідженням їх ефективності щодо зменшення кількості рецидивів та запобігання розвитку ускладнень офтальмогерпесу.

Об’єкт і методи дослідження

Під нашим спостереженням перебували 120 пацієнтів із ЗЗО герпесвірусної етіології, які були направлені терапевтами, офтальмологами та іншими спеціалістами на кафедру клінічної імунології та алергології з секцією медичної генетики Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця у зв’язку з неефективністю чи нетривалим ефектом стандартної терапії, яка включала застосування місцево крапель інтерферону альфа, тіотриазоліну та системно препаратів групи ацикловіру. У дослідну групу ввійшли 60 хворих із різними клінічними формами герпесвірусного ураження очей. У всіх пацієнтів дослідної групи виявилася неефективною традиційна профілактична терапія офтальмогерпесу неодноразово або відзначалися виражені побічні ефекти препаратів, що унеможливлювало їх подальший прийом.

До групи порівняння відібрано 20 хворих на офтальмогерпес, які отримували стандартне лікування препаратами групи ацикловіру та місцевими очними краплями.

Для проведення порівняльного аналізу нами створена контрольна група із 20 здорових пацієнтів, віковий розподіл обстежених в якій відповідав розподілу в дослідній групі.

Усім пацієнтам проведено визначення показників системного та місцевого імунітету: загальний аналіз крові з розгорнутою лейкоцитарною формулою та рівнем тромбоцитів із визначенням абсолютної кількості лімфоцитів; кількості лімфоцитів та їх субпопуляцій у периферичній крові проводили методом непрямої імуно­флюоресценції за допомогою лазерного проточного цито­флоуриметра; визначення рівнів сироваткових імуноглобулінів IgG, IgM, IgA здійснювали за допомогою методу простої радіальної імунодифузії за Манчині; визначення фагоцитарного числа (ФЧ) у латексному тесті; великі гранулярні лімфоцити (ВГЛ) виявляли цитологічним методом; концентрацію цитокінів — фактора некрозу пухлини (ФНП)-α у крові та слині, сироваткового гамма-інтерферону (γ-ІФН) та сироваткового інтерлейкіну-10 (ІЛ-10) — імуноферментним методом.

Результати та їх обговорення

Результати вивчення співвідношення субпопуляцій лімфоцитів за допомогою методу непрямої імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл до антигенів CD3⁺, CD3⁺4⁺, CD3⁺8⁺, CD3^–CD56⁺, CD19⁺ у пацієнтів із ЗЗО герпесвірусної етіо­логії (дослідна група та група порівняння) та у пацієнтів контрольної групи наведено у табл. 1.

Таблиця 1 Середні рівні лімфоцитів різних субпопуляцій в учасників дослідження, % (М±m)

У табл. 1 і 2: *, **р<0,05 та р<0,01 відповідно порівняно з контрольною групою.

Як свідчать дані (див. табл. 1), у пацієнтів з офтальмогерпесом рівень CD3⁺-клітин перебував у межах норми і вірогідно не відрізнявся від аналогічного показника у конт­рольній групі. Однак порівняно з контрольною групою відзначається вірогідне зменшення кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів (CD3⁺CD8⁺-клітин) у хворих дослідної групи (t=2,01; р<0,05; показник набагато нижчий від норми) та групи порівняння (t=2,14; р<0,05). При структурному аналізі вибірки нами встановлено, що рівень CD3⁺CD8⁺– клітин у ме­жах норми мали лише 7 (11,7%) хворих дослідної групи, підвищення рівня цитотоксичних Т- лімфоцитів не виявлено в жодному з випадків. Стійке в динаміці зниження рівня цитотоксичних Т-лімфоцитів виявлено у більшості пацієнтів дослідної групи — у 53 (88,3%) хворих. Цей дефект супроводжується вірогідним зниженням CD3^–CD56⁺– лімфоцитів або NК(Natural Killer)-клітин. В умовах дефіциту кілерних клітин (CD3⁺CD8⁺– та CD3^–CD56⁺– лімфоцитів), які були виявлені у хворих на офтальмогерпес, неможливою є повноцінна елімінація герпесвірусів з організму, що зумовлює тривалість перебігу та надзвичайно високу частоту рецидивування офтальмогерпесу у пацієнтів дослідної групи.

Рівень В-лімфоцитів у хворих дослідної групи вірогідно перевищує аналогічний показник у пацієнтів контрольної групи (t=3,66; р<0,01). При проведенні структурного аналізу вибірки встановлено, що зниження рівнів CD19⁺-лімфоцитів не було відзначено в жодному з випадків, а у 51 (85%) хворого дослідної групи спостерігалося підвищення їх вмісту в периферичній крові. Рівень В-лімфоцитів у хворих групи порівняння також був вірогідно вищим за відповідний рівень у пацієнтів контрольної групи (t=3,32; р<0,01).

За даними дослідження встановлено, що у 47 (78,3%) хворих дослідної групи відзначалося зниження вмісту природних кілерів (CD3^–CD56⁺-лімфоцитів), показники були вірогідно нижчими за аналогічні показники контрольної групи, середній відносний рівень становив 8,55±0,25% (t=7,2; р<0,001), середній абсолютний рівень — 0,28±0,017•10⁹/л (t=2,7; р<0,05). У решти 13 (21,7%) хворих відносний та абсолютний рівні CD3^–CD56⁺-лімфоцитів вірогідно не відрізнялися від аналогічних показників у контрольній групі (p>0,05).

У результаті аналізу даних, отриманих при обстеженні хворих групи порівняння, відзначено, що у всіх пацієнтів спостерігалося вірогідне зниження рівня природних кілерів, середній відносний рівень становив 8,96±0,47% (t=6,4; р<0,001), середній абсолютний рівень — 0,33±0,03•10⁹/л.

Отже, отримані дані підтверджено під час структурного аналізу вибірки, в результаті якого було отримано високу питому вагу низьких рівнів CD3^–CD56⁺-клітин. Саме такі показники дозволяють нам встановити значне зменшення кількості природних кілерів у хворих на ЗЗО, які перебували під нашим спостереженням (рис. 1).

Рис. 1

Середні рівні природних кілерів у дослідній, контрольній групах та групі порівняння

Також нами проводилося визначення ВГЛ у крові цитологічним методом. Необхідність паралельного визначення рівня ВГЛ зумовлена тим, що наявність гранул у цитоплазмі клітин свідчить про зрілість і функціо­нальну повноцінність ВГЛ, а природні кілери можуть експресувати характерні кластери диференціювання, однак не містити гранул, тобто бути функціонально неповноцінними (Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П., 2005). Саме тому для адекватної оцінки клітинної ланки природженого імунітету необхідно, крім CD3^–CD56⁺-лімфоцитів, визначати рівень ВГЛ.

Згідно з даними нашого дослідження середній відносний рівень ВГЛ у хворих на ЗЗО був значно нижчим за норму і становив 2,125±0,154% (норма >5%), середній абсолютний рівень ВГЛ у пацієнтів дослідної групи був зіставним із відносним значенням і становив 0,135±0,01•10⁹/л, що складає 54% нижньої межі норми (норма — 0,25–0,4•10⁹/л). Подібні зміни виявлено і у хворих на ЗЗО, які ввійшли у групу порівняння. Середній відносний рівень ВГЛ у обстежених осіб групи порівняння становив 2,25±0,30%, середній абсолютний рівень ВГЛ — 0,14±0,02•10⁹/л.

У 52 (86,7%) хворих дослідної групи спостерігалися низькі рівні ВГЛ. До того ж рівень ВГЛ при обстеженні в динаміці нижчий 0,1•10⁹/л був майже у половини пацієнтів з офтальмогерпесом (28 (46,7%) обстежених). І лише у 2 (3,3%) хворих дослідної групи відзначали стійке в динаміці підвищення рівня ВГЛ у крові, нормальні рівні ВГЛ мали лише 6 (10%) обстежених.

На рис. 2 продемонстровано питому вагу пацієнтів дослідної групи з різними рівнями ВГЛ.

Рис. 2

Питома вага хворих дослідної групи з різними рівнями ВГЛ

Зважаючи на те, що середній рівень CD19⁺ В-лімфоцитів у хворих дослідної групи значно відрізнявся від норми і був вірогідно вищим за аналогічний показник у контрольній групі, ми вважали за необхідне дослідити рівень продукції антитіл різних класів у хворих на ЗЗО герпесвірусної етіо­логії. У ході дослідження з’ясовано, що середні рівні антитіл вірогідно відрізнялися від таких у контро­льній групі, про що свідчать дані табл. 2, де наведено результати визначення рівня сироваткових імуноглобулінів IgG, IgM та IgA за методом радіальної імунодифузії в гелі у хворих на ЗЗО порівняно з контро­льною групою пацієнтів.

Таблиця 2 Концентрація сироваткових імуноглобулінів IgG, IgM та IgA у хворих на ЗЗО, г/л (М±m)

При порівнянні середніх рівнів імуноглобулінів різних класів з аналогічними показниками у контрольній групі виявлено вірогідне підвищення рівнів IgG та IgА, а також зниження рівня сироваткового IgM у пацієнтів дослідної групи та групи порівняння. При дослідженні структури вибірки встановлено, що лише у 11 (18,3%) пацієнтів дослідної групи мали місце нормальні рівні антитіл трьох різних класів у сироватці крові, хоча у контрольній групі це відзначали набагато частіше (у 80% випадків). Решта 49 хворих дослідної групи мали такі зміни: зниження рівня IgG спостерігалося у 5 (8,3%) обстежених, підвищення — у 4 (6,7%); зниження показника IgM виявлено у 19 (31,7%) пацієнтів, показник IgM вищий норми — лише у 3 (5%) випадках; підвищення рівня сироваткового IgА було зафіксовано у 14 (23,3%) хворих на офтальмогерпес, зниження — у 6 (10%) хворих.

Таким чином, виявлено суттєві порушення при вивченні структури вибірки рівнів імуноглобулінів у хворих дослідної групи. При цьому майже у третини хворих з відхиленнями у рівнях антитіл мали місце різноспрямовані зміни показників імуноглобулінів різних класів. Аналогічні зміни нами спостерігалися і в пацієнтів групи порівняння. Отримані дані дозволяють говорити про дисімуноглобулінемію у хворих на офтальмогерпес, які перебували під нашим спостереженням.

У ході подальших досліджень з’ясовано, що у пацієнтів із ЗЗО не виявлено вірогідних змін рівня ФЧ. Відповідні рівні наведено в табл. 3.

Однак у ході більш детального вивчення показників у хворих дослідної групи та групи порівняння виявлено, що середній рівень ФЧ нейтрофілів перебував на нижній межі норми. До того ж, при структурному аналізі вибірки встановлено, що у 18 (30%) пацієнтів дослідної групи відзначалося хоча і не дуже виражене (в межах від 50 до 59%), але стійке в динаміці зниження рівня ФЧ. Водночас 28 (46,7%) хворих мали ФЧ на нижній межі норми протягом всього дослідження, і лише у чверті хворих дослідної групи (14 (23,3%) обстежених) було виявлено нормальний рівень ФЧ нейтрофілів. Підвищення рівня ФЧ не виявлено в жодному з випадків. Схематично всі виявлені особливості зображено на рис. 3.

Рис. 3

Питома вага пацієнтів дослідної групи з різними рівнями ФЧ

Виявлені закономірності дали нам змогу зробити висновок, що помірне зниження фагоцитарної активності нейтрофілів у частини пацієнтів із ЗЗО було сприятливим фоном для активної реплікації вірусів родини герпесу та як наслідок — для частих рецидивів офтальмогерпесу у хворих дослідної групи.

Наступним етапом нашого дослідження стало визначення рівнів цитокінів у сироватці крові та слині хворих дослідної групи імуноферментним методом. Перш за все нами досліджено рівні продукції прозапальних цитокінів, оскільки, за даними більшості джерел літератури, саме їм надається найбільше значення в елімінації внутрішньоклітинних збудників, у тому числі й вірусів родини герпесу, адже вони активують клітинну ланку імунної системи, якій належить домінуюча роль у захисті від зазначених антигенів (Ершов Ф.И. и соавт., 1996; Шичкин В.П., 1998; Гранитов В.М., 2001; Лебедев В.В., 2002; Драннік Г.М. (ред.), 2006; Казмірчук В.Є., Ковальчук Л.В., 2006). Результати дослідження наведено на рис. 4.

Рис. 4

Сироваткові рівні ФНП-α, γ-ІФН та рівень ФНП-α у слині хворих дослідної групи порівняно з контрольною групою

Як видно (див. рис. 4), у контрольній групі показники досліджуваних прозапальних цитокінів перебували в межах норми — до 100 пкг/мл. У хворих на офтальмогерпес інфекційні агенти (віруси родини герпесу) підтримують постійний вірусний запальний процес зі значним підвищенням рівнів ФНП-α як у сироватці крові, так і на слизовій оболонці. Натомість середній рівень γ-ІНФ у сироватці крові вірогідно не відрізнявся від норми, хоча, як нам відомо з даних літератури (Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В., 1989; Balkwill F.R., Burke F., 1989; Чередеев А.Н., 1990; Пальцев М.А., 1996; Кадагидзе З.Г.,1997; Ярилин А.А., 1997; Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Кашкин К.П., 1998; Фрейдлин И.С., 1998; Нейко Є.М. та співавт., 2000; Ковальчук Л.В. и соавт., 2001), при зустрічі організму з вірусним агентом найбільш швидкою реакцією у відповідь на інфікування є продукція інтерферону, яка випереджає підключення специфічних гуморальних реакцій імунітету. γ-ІФН продукується переважно Тh1- клітинами і, в свою чергу, активує клітинні фактори імунної системи (NK-, К-клітини, цитотоксичні Т-лімфоцити та макрофаги), γ-ІФН забезпечує диференціювання лімфоцитів Th0 в Th1. Такий варіант розвитку імунної відповіді забезпечує ефективну імунну реакцію організму на віруси родини герпесу. Отриманий у проведеному нами дослідженні низький рівень γ-ІФН у хворих дослідної групи опосередковано може свідчити про низьку функціональну активність клітинного імунітету при активних формах герпесвірусної інфекції. Натомість у хворих групи порівняння спостерігалася тенденція до підвищення рівня γ-ІФН (9,39±0,69 пкг/мл).

Для вирішення питання щодо можливості переважаючої активності Тh2 і внаслідок цього розвитку неадекватної імунної відповіді на вірус у хворих на офтальмогерпес ми визначали рівень сироваткового ІЛ-10 у хворих дослідної групи порівняно з контрольною групою. ІЛ-10 відводиться особлива роль в імунній відповіді на герпесвірусну інфекцію, зокрема інфекцію вірусу Епштейна — Барр, оскільки аналог ІЛ-10 продукує сам вірус Епштейна — Барр (Носик Н.Н., 2000; Самарина В.Н., Сорокина О.А., 2000; Cohen J.I., 2000). При активних формах інфекції вірусу Епштейна — Барр рівень цього ІЛ у сироватці крові має бути вищим порівняно з латентною формою інфекції. Отримані нами дані дослідження рівнів сироваткового ІЛ-10 показано в табл. 4.

Згідно з даними (див. табл. 4) рівні сироваткового ІЛ-10 у хворих дослідної групи та групи порівняння вірогідно не відрізнялися від аналогічного показника в контрольній групі. Однак при структурному аналізі вибірки було з’ясовано, що надзвичайно низькі рівні сироваткового ІЛ-10 реєструвалися у 13 (37,1%) пацієнтів дослідної групи, а надзвичайно високі — у 6 (17,1%) хворих на офтальмогерпес. Таким чином, рівень ІЛ-10 перебував у межах норми лише у 16 (45,7%) обстежених, що є свідченням дезінтеграції імунної відповіді у хворих на часто рецидивуючі форми ЗЗО, що і призводить до тривалого існування вогнища запалення на слизовій оболонці очей та розвитку частих рецидивів захворювання.

Висновки

Після проведення визначення імунного статусу пацієнтів із ЗЗО герпесвірусної етіо­логії ми можемо графічно показати дефекти тієї чи іншої ланки імунної системи, які переважали у осіб із ЗЗО герпесвірусної етіології (рис. 5).

Із рис. 5 видно, що серед дефектів імунної системи переважають дефіцит цитотоксичних Т-лімфоцитів (53 (88,3%) хворих) та дефіцит рівня ВГЛ (52 (86,7%) хворих), трохи менше виявлено пацієнтів із дефіцитом природних кілерів — CD3^–56⁺-лімфоцитів (47 (78,3%) хворих). Найрідше у осіб із ЗЗО відзначається зниження фагоцитарної активності (18 (30%) хворих). Зазначені зміни супроводжувалися змінами функціональних показників стану імунної системи: у хворих на ЗЗО герпесвірусної етіології виявлено вірогідне підвищення рівня ФНП-α у сироватці крові та слині, а також вірогідне зниження рівня γ-ІФН у сироватці крові обстежених пацієнтів дослідної групи.

Рис. 5

Кількість пацієнтів із ЗЗО, які мають різні дефіцити, визначені скринінговими методами

Проаналізувавши ці дані, ми бачимо, що у хворих на офтальмогерпес найчастіше спостерігаються не ізольовані дефекти імунної системи, а накладання різних дефектів. Найчастіше у пацієнтів дослідної групи виявлялися поєднання дефіциту клітинної ланки вродженого та набутого імунітету, а саме поєднання зниження рівнів природних кілерів, ВГЛ та цитотоксичних Т-лімфоцитів.

Наявність у хворих дослідної групи клінічно маніфестної герпетичної інфекції на тлі вираженої недостатності клітинної ланки імунітету створює показання для проведення імунотропної терапії для пригнічення вірусних антигенів і посилення імунорезистентності.

Список використаної літератури

• Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. (1998) Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. Наукова думка, Київ, 313 с.
• Гранитов В.М. (2001) Герпесвирусная инфекция. Медицинская книга, Москва; Издательство НГМА, Нижний Новгород, 82 с.
• Драннік Г.М. (ред.) (2006) Клінічна імунологія та алергологія. Здоров’я, Київ, 888 с.
• Ершов Ф.И., Григорян С.С., Готовцев Е.П. (1996) Интерфероновый статус в норме и при различных заболеваниях. В кн: Ф.И. Ершов (ред.) Система интерферонов в норме и при патологии. Медицина, Москва, с. 135–146.
• Кадагидзе З.Г. (1997) Цитокины и их использование в онкологи. Int. J. Immunorehabilitation, 3: 48–56.
• Казмірчук В.Є., Ковальчук Л.В. (2006) Клінічна імунологія та алергологія. Нова книга, Вінниця, 526 с.
• Кашкин К.П. (1998) Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность (лекция). Клин. лаб. диагностика, 11: 21–32.
• Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. (2001) Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. Медицина, Москва, 158 с.
• Лебедев В.В. (2002) Супероксидные основы патогенеза и терапии иммунных расстройств. В кн.: В.В. Лебедев (ред.) Проблемы патогенеза и терапии иммунных расстройств. Москва, Т. 1, с. 6–35.
• Нейко Є.М., Александрук О.Д., Островський М.М. (2000) Фізіологія цитокінів. Галиц. лікар. вісн., 4: 153–158.
• Носик Н.Н. (2000) Цитокины при вирусных инфекциях. Вопросы вирусологии, 1: 4–10.
• Пальцев М.А. (1996) Цитокины и их роль в межклеточном взаимодействии. Архив патологии, 58(6): 3–7.
• Самарина В.Н., Сорокина О.А. (2000) Детские инфекционные болезни. BINOM, Москва; Невский Диалект, Санкт-Петербург, 317 с.
• Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П. (2005) Физиология естественных киллеров. Медицина-Здоровье, Москва, 455 с.
• Фрейдлин И.С. (1998) Цитокины в клинике. В кн.: Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. Сб. тр. РААКИ. Москва, с. 104–112.
• Чередеев А.Н. (1990) Интерлейкины: функциональная роль как медиаторов иммунной системы (обзор литературы). Лаб. дело, 10: 4–11.
• Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. (1989) Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов. Итоги науки и техники. Иммунология, Т. 19, ВИНИТИ, Mосква,. 238 с.
• Шичкин В.П. (1998) Патогенетическое значение цитокинов и перспектива цитокин/антицитокиновой терапии. Иммунология, 2: 9–13.
• Ярилин А.А. (1997) Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии. Иммунология, 3: 7–14.
• Balkwill F.R., Burke F. (1989) The cytokine network. Immunol. Today, 10(9): 299–304.
• Cohen J.I. (2000) Epstein-Barr virus infection. N. Engl. J. Med., 343(7): 481–492.

Адреса для листування:
Удовенко Наталія Сергіївна
04080, Київ, вул. Турівська, 26
Дитяча поліклініка № 3
Подільського району м. Києва, к. 332