Свободнорадикальное окисление липидов у больных хроническим лимфолейкозом

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что главным звеном в возникновении и развитии патологического процесса в организме является поражение мембран, повреждение активными формами кислорода их липидного слоя. Активация этих процессов на фоне снижения активности системы антиоксидантной защиты (АОЗ) вызывает синдром пероксидации. Образование перекисей может вызывать появление кластогенных веществ, повреждающих хромосомы и образующих в свою очередь липопере­киси, что обеспечивает длительный генотоксический эффект (Emerit I., 1999; Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., 2000). Активные формы кислорода и цитотоксические продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) могут стимулировать метаболизм арахидоновой кислоты с образованием простаноидов, отягощающих течение болезни. В последнее время появились доказательства участия липоперекисей в инициировании путей передачи сигнала в клетке, ведущих либо к усилению защитной системы клетки, либо к апоптозу или некрозу (Kerr J.F. et al., 1994; Garland J.M. et al., 1997; Schuler D., Szende B., 1997; Girotti A.W., 1998). Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) входит в группу заболеваний, возникновение которых прежде всего связывают не с повышенной пролиферацией опухолевого клона, а с неэффективностью апоптоза (Назарова Е.Л. и соавт., 2000; Логінський В.О. та співавт., 2002). Найденная у подавляющего большинства больных актива­ция гена bcl‑2, препятствующего апоптозу, повышается по мере прогрессирования болезни (Wickremasinghe R.G., Hoffbrand A.V., 1999).

Цель работы — изучение активности процессов свободнорадикального окисления липидов у больных ХЛЛ.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 79 больных в возрасте от 34 до 83 лет с В‑клеточной формой ХЛЛ (В‑ХЛЛ) в стадии выраженных клинико‑гематологических прояв­лений — стадия III по классификации K.R. Rai (Rai K.R. et al., 1975; Rai K.R., 1987), находящихся на лечении в отделении заболеваний системы крови с группой клинической биохимии Института гематологии и трансфузиологии АМН Украины. Верификацию диагноза, определение стадии заболевания производили на основе данных общеклинического обследования, оценки показателей периферической крови, костномозгового пунктата и трепанобиоптата, результатов цитохимического исследования и иммунофенотипирования лимфоцитов. В зависимости от наличия/отсутствия гемолиза эритроцитов больные были условно разделены на две группы: I группа — 45 человек, у которых не был выявлен гемолиз эритроцитов, II группа — 34 обследованных с выявленным гемолизом. В II группе выделено три подгруппы: ІІа — 14 больных, у которых были обнаружены антитела против собственных антигенов эритроцитов; ІІб — 13 обследованных, у которых был выявлен свободный гемоглобин плазмы крови; ІІв — 7 человек, у которых отмечены и антитела, и свободный гемоглобин плазмы крови. В зависимости от количества эритроцитов и концентрации гемоглобина обследо­ванных также условно разделили на две группы: III группа — 39 больных с количеством эритроцитов (Er) более 3,2×10¹²/л и концентрацией гемоглобина (Hb) более 103 г/л, IV группа — 40 обследованных с более низкими показателями Hb и Er. В IV группе также выделено три подгруппы: IV₁ — больные с гемоглоби­ном от 90 до 70 г/л (13 человек), IV₂ — с гемо­гло­бином менее 70 г/л (19 человек), IV₃ — с гемо­гло­би­ном 91–103 г/л (8 больных). Конт­рольную группу составили 28 здоровых лиц (доноры). Обследование проводили до начала курса химиотерапии.

Активность ПОЛ исследовали модифицированным методом И.А. Волчегорского (Аношина М.Ю., Лановенко И.И., 1994). При пероксидации нейт­ральных липидов (гептановая фаза липидных экст­рактов) и фосфолипидов (изопропанольная фаза) в эритроцитах и плазме крови определяли такие показатели: уровень субстратов ПОЛ (по концентрации продуктов с изолированными двойными связями (ИДС)), содержание первичных молекулярных продуктов липопероксидации — диеновых (ДК) и триеновых (ТК) конъюгатов, вторичных — оксодиеновых конъюгатов (ОДК) и конечных продуктов ПОЛ — типа шиффовых оснований (ШО). Содержание фетального гемоглобина определяли по методу О.Г. Гаджиева, Р.Ш. Рустама (1988), свободного гемоглобина плазмы крови — О.Н. Савельева и соавторов (1990). Статистическую обработку результатов проводили с использованием Excel (Лапач С.Н. и соавт., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в плазме крови больных В‑ХЛЛ наблюдают активизацию процессов ПОЛ. При пероксидации нейтральных липидов содержание ИДС возрастает по сравнению с контрольной группой от 3,655±0,840 Е/мл до 5,389±1,187 Е/мл, ДК — от 2,658±0,538 Е/мл до 4,300±0,981 Е/мл. Межгрупповых различий не выявлено. Концентрация ТК и ОДК повышается соответственно в 3,35–6,10 и 4,12–11,03 раза, уровень ШО статистически достоверно не изменяется. Установлены отличия показателей ТК в І–ІІа, І–ІІв, ІV–IV₃, IV₂–IV₃ группах (р<0,05) и ОДК — в IV₂–IV₃ группах (р<0,05). При перекисном окислении фосфолипидов отмечено достоверное, по сравнению с контрольной группой, повышение концентрации ИДС у больных ІІб, IV и IV₂ групп. Выявлены различия в показателях у больных І–ІІа, III–IV, IV₁–IV₃ (р<0,05), IV–IV₃, IV₂–IV₃ (р<0,01) групп. Значимо, по сравнению с контролем, увеличивается содержание ШО (у всех больных В‑ХЛЛ), ДК, ТК и ОДК (кроме больных ІІв группы). Выявлены межгрупповые различия.

Снижение гемоглобина у больных IV группы коррелировало с повышением концентрации ИДС (r=–0,561; p<0,001), ДК (r=–0,659; p<0,001), ТК (r=–0,614; p<0,001), ОДК (r=–0,613; p<0,001) и ШО (r=–0,403; p<0,01). В обратной зависимости находится количество эритроцитов и концентрация ИДС (r=–0,602; p<0,001), ДК (r=–0,642; p<0,001), ТК (r=–0,578; p<0,001) и ОДК (r=–0,588; p<0,001). Для больных III группы (с более высоким уровнем Hb и Er) установлена корреляционная взаимосвязь между количеством Er и уровнем ИДС, ДК и ТК: r=0,387, p<0,001; r=0,388, p<0,001; r=0,347, p<0,001 соответственно. Для больных I–II групп выявлена обратная корреляция между продуктами пероксидации фосфолипидов плазмы крови и концентрацией Hb, но для больных с гемолизом эритроцитов не установлено корреляционной взаимосвязи показателей Hb и ШО. Также отличаются корреляционные взаимоотношения и с Er: для больных I группы — только с ДК (r=–0,292; р<0,05) и ШО (r=–0,371; p<0,01); для II группы — с ИДС (r=–0,537; р<0,001), ДК (r=–0,591; p<0,001), ТК (r=–0,625; p<0,001) и ОДК (r=–0,663; p<0,001). Кроме того, у больных II группы выявлена корреляция между количеством эритроцитов и концентрацией фетального гемоглобина: (r=–0,348; p<0,05).

Установлено также изменение относительного содержания молекулярных продуктов ПОЛ: пер­вичных — ДК/ИДС; вторичных — ОДК/ИДС; конечных — ШО/ИДС. При пероксидации нейтральных липидов отмечено достоверное увеличение: ДК/ИДС — в 1,2–1,4 раза; ОДК/ИДС — в 2,0–2,9 раза и снижение ШО/ИДС — в 2,1–5,0 раза; при пероксидации фосфолипидов повышение соответственно: в 1,3–1,7; в 1,3–1,5 и 2,1–3,3 раза (р<0,05). Имеются достоверные различия в межгрупповых показателях.

Результаты исследований показали, что значительно нарушены процессы пероксидации липидов и в эритроцитах больных В‑ХЛЛ. При перекисном окислении нейтральных липидов более чем в 12 раз увеличено содержание ИДС, в 14 — ДК, в 4 — ТК и ОДК. Межгрупповых отличий не выявлено. При пероксидации фосфолипидов отмечена не только активация процессов ПОЛ, но и установлено, что в группах больных с более низкими показателями эритроцитов и гемоглобина выявляются более вы­сокие уровни ИДС, первичных, вторичных и конечных молекулярных продуктов липопероксидации. Так, концентрация ИДС — 3,854±0,732 Е/мл и 5,687±0,558 Е/мл; ДК — 2,846±0,534 Е/мл и 4,627±0,589 Е/мл; ТК — 1,781±0,207 Е/мл и 2,457±0,221 Е/мл; ОДК — 1,526±0,188 Е/мл и 2,064±0,212 Е/мл; ШО — 0,251±0,025 Е/мл и 0,384±0,048 Е/мл соответственно у больных IV₁–IV₂ групп (р<0,05).

При пероксидации фосфолипидов эритроцитов у больных IV группы установлена обратная корреляционная взаимосвязь концентрации Hb с ИДС (r=–0,532; p<0,001), ДК (r=–0,522; p<0,001), ТК (r=–0,470; p<0,001), ОДК (r=–0,420; p<0,01), ШО (r=–0,588; p<0,001); количества Er с ИДС (r=–0,366; p<0,05), ДК (r=–0,358; p<0,05) и ШО(r=–0,403; p<0,01). Такая же корреляционная зависимость между Hb и этими молекулярными продуктами показана для больных II–III групп, а для I группы — только с ТК, ОДК, ШО. Есть различия между группами в корреляционных взаимосвязях с Er: для I и III групп — только с ШО: r=–0,360; p<0,01 и r=0,332; p<0,05 соответственно; для II группы — с ТК (r=–0,347; p<0,05) и для IV — с ИДС (r=–0,366; p<0,05), ДК (r=–0,358; p<0,05) и ШО (r=–0,431; p<0,01).

Анализируя коэффициенты распределения (соотношение сходных показателей в эритроцитах и плазме крови, характеризующее собой степень выраженности нарушений обменных процессов между ними), в обеих фазах липидных экстрактов установлено их повышение (р<0,05) для ДК, ТК и ОДК — в изо­пропанольной фазе, что свидетельствует о накоплении в эритроцитах этих продуктов. Коэффициент распределения конечного продукта пероксидации фос­фолипидов ШО снижается (р<0,05) до 1,367±0,058–1,815±0,229 Е/мл при норме 2,510±0,330 Е/мл на фоне повышенного содержания в плазме крови, что указывает на усиление деструктивных процессов и нарушение целостности мембран эритроцитов. Это подтверждает выявленное ранее нарушение проницаемости эритроцитарной мембраны у всех больных В‑ХЛЛ (Аношина М.Ю. и соавт., 2001; Романова А.Ф. и соавт., 2001). У больных I–IV групп увеличен коэффициент ДК/ШО, позволяющий косвенно судить о состоянии антиокси­­дантной защиты организма при пероксидации нейт­ральных липидов в 9,6–31,8 раза, фосфолипидов в 2,2–3,6 (р<0,05). Это может свидетельствовать о срыве компенсаторно‑приспособительных меха­низмов в организмах больных В‑ХЛЛ в стадии вы­раженных клинико‑гематологических проявлений.

Как известно, компенсаторно‑приспособительные и патогенетические процессы сопровождаются изменениями фракционного состава клеточных мембран, прежде всего липидного. Метаболизм липидов мембраны связан интенсивным обменом с липидным составом плазмы крови и через нее с липидным обменом организма в целом. Отклонения от нормы в любом звене обмена липидов могут сопровождаться нарушениями структуры и функции клеточных мембран, в том числе и эритроцитов. У больных В‑ХЛЛ в III стадии по классификации K.R. Rai нами установлены нарушения в липидном обмене: изменяется концентрация β‑липопротеидов, уровень холестерина. Изменение проницаемости мембран эритроцитов может быть связано с угнетением синтеза эфиров холестерина, обусловленное напряжением процессов оксидоредукции, нарушением процессов тканевого дыхания, гипоксией. У больных В‑ХЛЛ с анемией разной степени отмечено достоверное повышение уровня фе­тального гемоглобина в эритроцитах — до 1,282±0,235–3,418±0,607% при 0,850±0,090% в контроле, (р<0,05), что подтверждает наличие ги­поксии.

Известно, что цитотоксическую роль играют не только активные радикалы, но и сами продукты ли­попероксидации, в частности триены, оксодиены, в состав которых входит и малоновый диальдегид (МДА). В здоровом организме эритроциты содержат 80–85% связанного и 15–20% свободного МДА. При ХЛЛ содержание ОДК возрастает, что ведет к изме­нению активности мембранных ферментов и метаболизма фосфолипидов. Эти метаболические модификации эритроцитов могут способствовать развитию тканевой гипоксии, усугубляющей течение заболевания. Накопление продуктов пероксидации как нейт­ральных липидов, так и фосфолипидов в плазме крови может быть связано не только с выходом их из эритроцитов, в связи с избыточным накопле­нием, но и из тканей, в первую очередь из печени и почек (при ХЛЛ в III стадии по классификации K.R. Rai часто отмечается нарушение их функционального состояния), а также со снижением активности системы АОЗ. Чрезмерная активность механизма шиффообразования, являющегося одним из механизмов утилизации липоперекисей, может возникать вследствие снижения эндогенных механизмов АОЗ, что и наблюдается у больных В‑ХЛЛ с анемией. Нами установлено снижение перекисной резистентности эритроцитов в 2,1–3,9 раза по сравнению с контрольной группой (р<0,009), активности каталазы — до 15,280±1,653–19,733±1,615 ммоль/л/мин при нор­- ме 24,796±0,563 ммоль/л/мин (р<0,002); по данным A. Kumerova и соавторов (1998) при ХЛЛ изменяется активность супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и глюкозо‑6‑фосфатдегидрогеназы.

Перекисное окисление ненасыщенных цепей фосфолипидов является одним из основных звеньев механизма барьерной и матричной функции мембран. В эритроцитах при активации ПОЛ в мембране появляются модифицированные активным кислородом фосфолипиды, способные увеличивать гидрофильность мембраны и нарушать липид‑липидные и белок‑липидные взаимодействия. Нарушение соотношения холестерина и фосфолипидов в мембране эритроцитов больных В‑ХЛЛ (подтверждение тому — разная степень окисленности нейтральных липидов и фосфолипидов) способствует гемолизу.

В основе гемолиза лежит трансформация клетки из диска в сферу, что обусловлено изменением про­ницаемости мембран, образованием на ее по­верхно­сти полостей, формированием «ситоподобной» структу- ры, через которые происходит пря­мая утечка молекул гемоглобина. Выход гемоглобина из эритроцитов может в свою очередь стимулировать ПОЛ эритроцитарных мембран, так как гемо­глобин в сво­бодном состоянии проявляет прооксидантные свойства. По нашим данным у больных с гемо­лизом эритроцитов концентрация гемоглобина и количество эритроцитов значительно ниже, чем у больных без гемолиза: соответственно 73,500±8,167 г/л, 2,426±0,283×10¹²/л против 104,818±4,157 г/л, 3,528±0,157×10¹²/л.

Известно, что ненасыщенные жирные кислоты в норме и при патологии являются эндогенными биорегуляторами, характеризующимися широким спектром биологического действия, в филогенезе определяют процессы длительной адаптации. Они регулируют рост и развитие клеток, механизмы взаимоотношения на уровне клеточных сообществ, гемокоагуляцию и тромбообразование, тонус стенки сосудов и синдром воспаления (Титов В.Н. и соавт., 2001). Мерой нена­сыщенности липидов является показатель ИДС. При ХЛЛ, по нашим данным, уровень ИДС значи­тельно повышается, что совпадает с результатами, по­лученными методом титрования озоном (Титов В.Н. и соавт., 2001). Нами показано: чем выше степень анемии при ХЛЛ, тем выше концентрация двойных связей при пере­­кисном окислении фосфолипидов эритроцитов 5,687±0,558 Е/мл и плазмы крови 11,447±1,197 Е/мл у больных IV₂ группы против соответственно 4,397± 0,708 и 7,693±0,562 Е/мл у больных III группы (р<0,05). Концентрация ИДС в плазме крови при пер­оксидации фосфолипидов имеет обратные корреляционные взаимоотношения с количеством тромбоцитов (Tr), лейкоцитов (L), лимфоцитов (Lm) и скоростью оседания эритроцитов (СОЭ). Так, для больных IV₂ груп­пы: c Tr (r=–0,535; p<0,01); c L (r=–0,782; p<0,001); c СОЭ (r=–0,845; p<0,001); для больных III группы: с Lm (r=–0,410; p<0,01); c СОЭ (r=–0,330; p<0,05). Также установлена корреляция между показателями периферической крови и концентрацией ИДС при пероксидации нейтральных липидов эритроцитов и плазмы крови. ИДС эритроцитов коррелируют у больных IV₂ группы: с Er (r=–0,487; p<0,01); c Lm (r=–0,673; p<0,001); у больных III группы только с Tr (r=0,347; p<0,05). ИДС плазмы крови имеет корреляционные взаимоотношения у больных IV₂ группы: с Er (r=–0,565; p<0,01); с L (r=–0,476;p<0,05); c СОЭ (r=–0,543; p<0,01); у больных III группы — только с Lm (r=0,375; p<0,05). Выявлены корреляционные взаимоотношения ИДС с показателями периферической крови и у больных I–II групп.

ВЫВОДЫ

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что у больных В‑ХЛЛ имеются значительные метаболические нарушения на клеточно‑молекулярном уровне. Прогрессирование болезни, развитие анемии и гипоксии сопровождается активацией и в эритроцитах, и в плазме крови процессов перекисного окисления как нейтральных липидов, так и фосфолипидов. При пероксидации фосфолипидов отмечена не только активация процессов ПОЛ, но и показано, что в группах больных с более низкими показателями эритроцитов и гемо­глобина выявляются более высокие уровни субстратов, первичных, вторичных и конечных молекулярных продуктов липопероксидации. При пероксидации фосфолипидов эритроцитов установлена обратная корреляционная взаимосвязь концентрации Hb с ИДС (r=–0,532; p<0,001), ДК (r=–0,522; p<0,001), ТК (r=–0,470; p<0,001), ОДК (r=–0,420; p<0,01), ШО (r=–0,588; p<0,001), количества Er с ИДС (r=–0,366; p<0,05), ДК (r=–0,358; p<0,05) и ШО (r=–0,403; p<0,01). Чем выше степень анемии, тем выше концентрация ИДС при перекисном окислении фосфолипидов эритроцитов и плазмы крови. Концентрация ИДС в плазме крови при пероксидации фосфолипидов имеет обратные корреляционные взаимоотношения с количеством тромбоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов и СОЭ. Также установлена корреляция между уровнем ИДС и показателями периферической крови при пероксидации нейтральных липидов.

ЛИТЕРАТУРА

• Аношина М.Ю., Лановенко И.И. (1994) Оценка свободнорадикального окисления липидов в эритроцитах и плазме крови. Фізіологічний журн., 40(5–6): 51–56.
• Аношина М.Ю., Третяк Н.Н., Романова А.Ф., Перехрестенко Т.П., Яговдик М.В., Павлюк Р.П. (2001) Функциональное состояние эритроцитов у больных хронической лимфоидной лейкемией (ХЛЛ). Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. Київ, 10(2): 139–144.
• Гаджиев О.Г., Рустам Р.Ш. (1988) Определение содержания фетального гемоглобина в образцах из капиллярной крови. Лаб. дело, 8: 34–36.
• Губский Ю.И., Левицкий Е.Л. (2000) Геном, метаболизм, болезни, лекарства. Лікування та діагностика, 4: 23–29.
• Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. (2000) Статистические методы в медико‑биологических исследованиях с использованием Excel. МОРИОН, Киев, 320 с.
• Логінський В.О., Виговська Я.І., Кароль Ю.С. та ін. (2002) Експресія CD95 при хронічній лімфоцитарній лейкемії і кореляція з відповіддю на лікування. Онкологія, 4(2): 89–93.
• Назарова Е.Л., Загоскина Т.П., Щардаков В.И. (2000) Анализ экспрессии маркера СД 95 на лимфоидных элементах больных хроническим лимфолейкозом. В кн.: Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. Материалы научн.‑практ. конф., 6–8 июня 2000 г., Санкт‑Петербург, с. 123.
• Романова А.Ф., Перехрестенко Т.П., Павлюк Р.П., Аношина М.Ю. (2001) Гемолитический компонент в развитии анемии у больных хроническим лимфолейкозом пожилого и старческого возраста. Пробл. старения и долголетия, 1: 57–64.
• Савельев О.Н., Сухоруков В.П., Киселева А.В., Королева Г.А. (1990) Определение свободного гемоглобина плазмы крови гемиглобинцианидным методом. Лаб. дело, 10: 45–47.
• Титов В.Н., Лисицин Д.М., Творогова М.Г., Амелюшкина В.А. (2001) Определение двойных связей в липидах сыворотки крови: метод титрования озоном, патофизиология и диагностическое значение (обзор литературы). Клин. лаб. диагностика, 7: 3–9.
• Emerit I. (1999) Clastogenic factors as biomarkers of oxidative stress after radiation exposure. Int. J. Radiat. Med., 2(2): 25–33.
• Garland J.M., Sondergaard K.L., Jolly J. (1997) Redox regulation of apoptosis in interleukin‑3‑dependent haemopoietic cells: absence of alteration in both mitochondrial membrane potential (delta psi(m)) and free radical production during apoptosis induced by IL3 withdrawal. Brit. J. Haematol., 99(4): 756–765.
• Girotti A.W. (1998) Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. J. Lipid. Res., 39(8): 1529–1542.
• Kerr J.F., Winterford C.M., Harmon B.V. (1994) Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 73(8): 2013–2026.
• Kumerova A., Leсe A., Skesters A., Silova A., Petuhovs V. (1998) Anaemia and antioxidant defenсe of the red blood cells. Mater. Med. Pol., 30(1–2): 12–15.
• Rai K.R. (1987) A critical analysis of staging in CLL. In: R.P. Gale, K. Rai (Eds.) Chronic Lymphocytic Leukemia: Recent Progress and Future Directions. Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 253–264.
• Rai K.R., Sawitsky A., Cronkite E.P. et al. (1975) Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 46: 219–234.
• Schuler D., Szende B. (1997) Apoptosis and acute lymphocytic leukemia in children. Ann. N.Y. Acad. Sci., 824: 28–37.
• Wickremasinghe R.G., Hoffbrand A.V. (1999) Biochemical and genetic control of apoptosis: relevance to normal hematopoiesis and hematological malignancies. Blood, 93(11): 3587–3600.

Адрес для переписки:

Аношина Милитина Юрьевна

04060, Киев, ул. М. Берлинского, 12

Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины, отделение заболеваний системы крови с группой клинической биохимии