Репродуктология: от науки к практике

5–7 апреля 2012 г. в Киеве прошел Международный симпозиум по вопросам репродуктивной медицины «От науки к практике», организаторами которого выступили Министерство здравоохранения Украины, Украинская ассоциация репродуктивной медицины (УАРМ) и Буковинский государственный медицинский университет.

Современные представления о процессе фолликулогенеза осветил в своем докладе профессор Рене Фридман, советник министра науки и здравоохранения Франции, руководитель отделения гинекологии, акушерства и репродуктивной медицины больницы Антуана Беклера. Р. Фридман известен как пионер экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с применением агонистов гонадотропинрилизинг-гормона (ГнРГ) — с его помощью во Франции в 1982 г. появилась на свет первая девочка, зачатая с помощью ЭКО. В 2012 г. этой девочке, ставшей крестницей Р. Фридмана, исполнилось уже 30 лет, и совсем недавно Р. Фридман поздравлял свою крестницу Амандин с юбилеем.

Как известно, фолликулогенезом называется этапное развитие фолликулов от примордиальных через стадии первичных и вторичных до стадии третичных (преовуляторных) фолликулов, или граафовых пузырьков. В процессе фолликулогенеза овоцит проходит стадию большого роста, и в конце фолликулогенеза в овоците возобновляется мейоз. Фолликулогенез начинается в период полового созревания и продолжается до наступления менопаузы.

В организме человека фолликулогенез стартует, когда несколько фолликулов выходят из резервного пула, а кульминацией его является формирование обычно одного доминирующего фолликула в каждом менструальном цикле.

Фолликулогенез включает 4 фазы:

1. Инициация.

2. Ранний рост фолликулов.

3. Селекция из доступного пула фолликулов.

4. Созревание преовариального фолликула.

На ранних стадиях роста фолликула регуляция процесса фолликулогенеза осуществляется с помощью тесного взаимодействия фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и специфических локальных факторов. Последние продуцируются клетками фолликулярного эпителия, которые формируют вокруг развивающегося фолликула зернистый слой, и теки. Для реализации регулирующих влияний локальных факторов особое значение приобретают щелевые соединения между клетками зернистого слоя и овоцитом. В золе контактов этих клеток имеются специфические каналы, способные передавать межклеточные сигналы и обеспечивающие таким образом согласованное функционирование клеток — коннексоны. Коннексоны способны пропускать неорганические ионы и небольшие молекулы размером до 1 кДа. Эти каналы образованы несколькими структурными субъединицами — коннексинами. При мутации либо ином нарушении со стороны синтеза специфических коннексинов страдает кооперация между клетками: например, если в овоците не представлены коннексины Connexin (Cx)43 и Cx47, развития такого фолликула не происходит, несмотря на нормальный уровень ФСГ.

Доказано важное значение в процессах фолликулогенеза следующих субстанций:

1. Фактор роста стволовых клеток (Stem Cell Factor — SCF, kit-ligand — KL). Ингибиция этого фактора приводит к атрезии фолликула.

2. Ростовой фактор дифференцировки (Growth differentiation factor —GDF)-9 — представитель суперсемейства трансформирующих ростовых факторов (transforming growth factors — TGF) синтезируется соматическими клетками яичника и напрямую влияет на рост и функционирование овоцита, являясь необходимым фактором для фолликулогенеза.

3. Морфогенетический протеин кости (Bone morphogenetic protein (BMP)-15) — еще один член суперсемейства TGF — также является паракринным сигнальным фактором фолликулогенеза.

Под влиянием GDF-9 BMP-15 происходит рост овоцита: если в примордиальном фолликуле диаметр овоцита составляет ≈30 мкм, то в преантральном — уже ≈100 мкм. Особую роль в процессе роста овоцита играют клетки зернистого слоя (SCF, Luekemia inhibition factor) и теки (баланс андрогенов, BMP). Однако, несмотря на наличие большого числа стимулирующих факторов, большинство фолликулов, содержащихся в яичниках, все же остаются на примордиальной стадии и не вступают в фолликулогенез вследствие влияния инактивирующих агентов.

Профессор Карло Альвиджи (Carlo Alviggi) из Центра по лечению бесплодия Неаполитанского университета им. Фридриха II (Università degli Studi di Napoli Federico II), Италия, в докладе «Индивидуализация протоколов стимуляции» упомянул о том, что при выборе метода и средства овариальной стимуляции (ОС) следует использовать индивидуальный подход, принимая во внимание следующие факторы:

1. Демографические и антропометрические (возраст, индекс массы тела, расовая принадлежность).

2. Гормональный профиль (ФСГ, лютеинизирующий гормон — ЛГ, эстрадиол и др.).

3. Состояние здоровья.

4. Причина бесплодия.

5. Стаж бесплодия.

6. Наличие и особенности предыдущих циклов ЭКО.

7. Социально-экономические, религиозно-этические моменты.

На данный момент зачастую применяется эмпирический подход к подбору протокола ОС, при котором пациентки со сходными начальными характеристиками получают одинаковое лечение, при этом начальный уровень гормонов используется как предиктор ответа на ОС. Новейшие достижения в области репродуктологии направлены на то, чтобы минимизировать риск развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) и одновременно повысить вероятность успешной ОС с получением достаточного числа пригодных для оплодотворения яйцеклеток. С этой целью задействуют такие методы:

1. Определение уровня специфических маркеров: антимюллеровский гормон (Anti-Müllerian hormone — AMH), число антральных фолликулов (Antral follicle count — AFC), полиморфизм гонадотропинов.

2. Распределение пациенток по подгруппам для более тщательного подбора верного протокола ОС.

3. Обязательный учет соотношения затратность/эффективность и прочих социально-экономических факторов.

В то время как концентрации ФСГ, ЛГ, стероидных гормонов скорее отражают активность больших, растущих фолликулов, AMH продуцируется клетками зернистого слоя мелких примордиальных фолликулов, составляющих так называемый овариальный резерв, потому с помощью определения уровня AMH в крови можно точнее прогнозировать ответ яичников на внешнюю стимуляцию (например вероятность развития СГЯ) (таблица).

Уровень AMH, пкмоль/л	Ожидаемый ответ на ОС	Начальная доза ФСГ, МЕ	Протокол ОС
>15	Высокий	150	Антагонисты ГнРГ (для предупреждения преждевременного пика ЛГ) Нормальное число овоцитов после ОС. Низкий риск СГЯ. Низкая потребность в криконсервации эмбрионов. Высокая частота беременности (CPR — clinical pregnancy rate).
5–15	Нормальный	225–300	Агонисты ГнРГ (для десенситизации гипофиза со снижением уровня эндогенного ФСГ) Низкий риск прерывания протокола. Низкий риск СГЯ.
<5	Низкий	375	Высокие дозы ФСГ: длительная стимуляция, высокий риск прерывания.Применение антагонистов ГнРГ: короткая стимуляция, средний риск прерывания.

Помимо того, при индивидуализации протоколов ОС для расчета стартовой дозы ФСГ обязательно следует учитывать показатель AFC. Набирающий популярность алгоритм CONSORT (CONsistency in r-FSH Starting dOses for individualized tReatmenT) предусматривает, помимо AFC, учет начального уровня ФСГ, индекса массы тела и возраста пациента при выборе стартовой дозы ФСГ (с шагом 37,5 МЕ).

Есть также некоторые генетические маркеры, роль которых в формировании овариального ответа на ФСГ в настоящее время обсуждается: к примеру, значение полиморфизма в гене FSH-R (Follicle-stimulating hormone-Receptor) доказано исследованиями, однако механизм реализации его влияния неясен. Значение таких маркеров, как AMH-Receptor (AMH-R)-2, Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)-2, Variant Luteinizing Hormone (V-LH) и некоторых прочих, пока нельзя считать достоверно доказанным, однако работы в этом направлении ведутся. В частности, наличие V-β-LH (менее биологически активной вариации ЛГ) ассоциируется с высокой вероятностью слабого ответа на ФСГ в процессе ОС, что заставляет обычно применять ФСГ в высоких дозах и длительные протоколы ОС.

К. Альвиджи также упомянул о том, что в Центре по лечению бесплодия он и его коллеги придерживаются, если есть возможность, так называемой мягкой стратегии ОС с последующим переносом 1 эмбриона (стандартная схема подразумевает перенос 2 эмбрионов). Такая стратегия способствует сокращению числа прежде­временных родов и снижает вероятность неблагоприятного исхода родов при сравнимой со стандартной схемой частотой наступления беременности (ЧБ).

Таким образом, при индивидуализации протокола ОС необходимо сперва спрогнозировать возможную силу ответа конкретного пациента на экзогенный ФСГ. Определение уровней AMH, AFC поможет подобрать верную стартовую дозу ФСГ, а также выяснить вопрос о необходимости применения аналогов ГнРГ (агонистов или антагонистов). Кроме того, необходимо обязательно учитывать психологические особенности пациента, социально-культурные и экономические факторы. Большие надежды К. Альвиджи возлагает на исследования, изучающие возможность применения генетических маркеров для оптимизации протоколов ОС.

Сантьяго Мунне (Santiago Munné), основатель и директор компании «Reprogenetics» (центральный офис — в Барселоне, Испания) выступил с докладом «Геномика для селекции эмбрионов». Вопрос селекции эмбрионов актуален при осуществлении ЭКО ввиду значительного риска развития хромосомных аномалий. Однако метод морфологического контроля по принципу time-lapse (эмбриоскопия), по мнению С. Мунне, недостаточно эффективен в данном отношении: по результатам совместных исследований Нью-Йоркского университета и «Reprogenetics», изо всех бластоцист, отобранных 4 эмбриологами с помощью метода эмбриоскопии, почти 50% оказались анеуплоидны. В лабораториях «Reprogenetics» в предимплантационной генетической диагностике широко применяется метод сравнительной геномной гибридизации (array-Comparative Genomic Hybridization — aCGH). ACGH позволяет диагностировать анеуплоидии и микроструктурные хромосомные аномалии одномоментно во всех 24 хромосомах и отличается значительно более высокой точностью, чем метод флюоресцентной гибридизации (FISH — Fluorescent in-situ Hybridization). Период проведения aCGH — всего 16 ч, что позволяет проводить биопсию не на 3-и, а на 5-е сутки с последующим переносом эмбриона в начале 6-х суток без потребности в их криоконсервации. При этом для проведения анализа нет необходимости в образцах родительской ДНК.

О современных взглядах на тактику ведения пациентов с многократными неудачными попытками ЭКО рассказала собравшимся директор по науке и развитию клиники «Надия», профессор кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии Киевского государственного медицинского университета Ирина Судома. Существует несколько толкований самого понятия «многократные неудачные попытки»: согласно данным B. Tan и соавторов (2005), многократными считается ≥2 не­удачных попыток применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), E.J. Margalioth и соавторы (2006) числом неудачных попыток считают ≥3.

При ведении таких пациентов следует учитывать некоторые общие положения:

• ЧБ существенно не изменяется в течение первых 3 программ ВРТ, но значительно снижается после 4-й.
• Почти у 75% пациенток удается достичь беременности в течение первых 4 программ ВРТ.
• ЧБ зависит от возраста пациентки: на протяжении 4 программ ВРТ беременность наступает у 83% женщин в возрасте <35 лет; у 60% женщин в возрасте ≥35 лет при условии получения ≥6 яйцеклеток; у 33% — при услов­ии получения <6 яйцеклеток.
• Женщины в возрасте >40 лет с нормальным овариальным резервом имеют меньшую ЧБ при применении ВРТ, чем более молодые женщины с малым овариальным резервом.
• У женщин 43–45 лет вероятность самопроизвольного прерывания беременности достигает 70%.

В генезе многократных неудачных попыток ВРТ особое значение имеют следующие группы факторов:

1. Эмбриональные.

2. Имплантационные.

К эмбриональным факторам относятся:

• хромосомные аномалии гамет и эмбрионов;
• неоптимальные условия культивирования;
• уплотнение прозрачной оболочки яйцеклетки;
• погрешности при переносе эмбриона;
• прочие факторы (мутации митохондриальной ДНК, уменьшение числа митохондрий и др.).

К имплантационным факторам относятся:

• изменения со стороны эндометрия — гиперплазия, истончение эндометрия, сдвиг «имплантационного окна»;
• изменения матки — Т-образная, седловидная матка; большие миоматозные узлы, деформирующие полость матки; эндометриоз;
• иммунные изменения — аутоиммунные и аллоиммунные нарушения (антифосфолипидный синдром и др.); наследственные и приобретенные тромбофилии;
• курение, избыточная масса тела и ожирение.

Таким образом, наиболее вероятными кандидатами для многократных неудачных попыток ВРТ будут:

• женщины в возрасте >40 лет;
• женщины со сниженным овариальным резервом;
• пациенты с хромосомными аномалиями;
• тяжелое мужское бесплодие: <1 млн сперматозоидов в 1 мл эякулята, тератоспермия.

Кроме того, известно, что сбалансированные хромосомные дефекты отмечаются среди пациентов с многократными неудачными попытками ВРТ чаще, чем в среднем по популяции (≈2,5%). При анализе 3-дневных эмбрионов методом FISH хромосомные аномалии определяются в 67% случаев, если гаметы получены от лиц с многократными неудачными попытками ВРТ, и в 36% — при ином анамнезе. Сходные результаты получены и при проведении aCGH-исследования. Таким образом, проведение максимально тщательной предимплантационной генетической диагностики эмбрионов способно значительно повысить ЧБ; наилучшие результаты достигаются при селекции эмбрионов с помощью метода aCGH.

Маркос Месегер (Marcos Meseguer) из Университета Валенсии (Испания), научный директор IVI Valencia — крупнейшей клиники по лечению бесплодия в Испании, заинтересовал собравшихся докладом «Морфокинетика как метод селекции эмбрионов». М. Месегер обратил внимание на то, что и такой метод, как time-lapse видеомикроскопия эмбрионов, имеет широкие диагностические возможности. С помощью программируемого оборудования удается получить изображения эмбриона на разных стадиях (2–8 клеток; морула; бластоциста) для оценки периодов деления, плоскостей расхождения, размеров и симметричности клеток. По его мнению, видеомикроскопия эмбрионов при верном алгоритме ее использования вполне может предоставить достаточное число маркеров для осуществления эмбриоселекции.

Научный директор «Reproductive Bio­logy Associates» (Атланта, США) Питер Наги (Peter Nagy) представил вниманию участников симпозиума доклад «Витрификация ооцитов и банк донорских яйцеклеток». История попыток длительного сохранения эмбрионов насчитывает уже почти 30 лет: в 1983 г. впервые наступила беременность после переноса эмбриона, предварительно подвергшегося медленному замораживанию. При применении такого метода выживаемость эмбрионов составляет, по данным разных авторов, 50–90%, а вероятность наступления беременности после переноса достигает 20–50%. Витрификация как метод сверхбыстрой криоконсервации эмбрионов, позволяющий избежать фазы кристаллизации воды за счет быстрого перехода ее в стекловидное состояние, впервые была применена Л. Кулешовой и соавторами (1999). Поскольку во время заморозки возможно образование мелких кристаллов льда, способных повредить клетки, при замораживании эмбрионов используют криопротекторы, предупреждающие кристаллизацию воды в процессе охлаждения (этиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерол, сахароза и др.). Этот метод считается менее травматичным для эмбрионов и позволяет повысить их выживаемость до 84–97%.

Необходимость в криоконсервации эмбрионов возникает в следующих ситуациях:

• в процессе проведения протокола ЭКО получено несколько эмбрионов хорошего качества и не все они могут быть перенесены одномоментно;
• при развитии СГЯ, когда подсадку эмбрионов лучше осуществить через несколько месяцев, после относительной нормализации гормонального баланса;
• при возникновении острых или обострении хронических заболеваний у женщины в период проведения протокола ЭКО;
• если женщине предстоит проведение химиотерапии или лучевой терапии, через некоторое время после которой она планирует беременность;
• при применении в программе ВРТ донорской яйцеклетки;
• для создания банков донорских эмбрио­нов.

П. Наги полагает, что создание банков донорских эмбрионов — перспективное направление репродуктологии, которое позволит лучше синхронизировать процессы получения эмбриона и его переноса; создаст возможности осуществления карантина эмбриона, например по вирусу иммунодефицита человека и вирусным трансмиссивным гепатитам; предоставит больший выбор эмбрионов; помимо того, привлечение банков донорских эмбрионов окажется для реципиентов экономически более выгодным.

В ходе симпозиума о своих успехах и достижениях доложили также украинские репродуктологи и их коллеги из Беларуси, Казахстана, России. Мероприятие проходило в теплой и дружественной атмосфере, что позволило обменяться опытом специалистам и репродуктологам Украины и других стран, а также обсудить предложенные клинические случаи с коллегиальной выработкой верной тактики.

Список использованной литературы

• Alviggi C., Clarizia R., Pettersson K. et al. (2009) Suboptimal response to GnRHa long protocol is associated with a common LH polymorphism. Reprod. Biomed. Online, 18(1): 9–14.
• Ata B., Kaplan B., Danzer H. et al. (2012) Array CGH analysis shows that aneuploidy is not related to the number of embryos generated. Reprod. Biomed. Online, Feb. 25 [Epub ahead of print].
• Das M., Holzer H.E. (2012) Recurrent implantation failure: gamete and embryo factors. Fertil. Steril., Mar. 15 [Epub ahead of print].
• Gutiérrez-Mateo C., Colls P., Sánchez-García J. et al. (2011) Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos. Fertil. Steril., 95(3): 953–958.
• Heijnen E.M., Eijkemans M.J., De Klerk C. et al. (2007) A mild treatment strategy for in-vitro fertilisation: a randomised non-inferiority trial. Lancet, 369(9563): 743–749.
• Margalioth E.J., Ben-Chetrit A., Gal M., Eldar-Geva T. (2006) Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET. Hum. Reprod., 21(12): 3036–3043.
• Meseguer M., Herrero J., Tejera A. et al. (2011) The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod., 26(10): 2658–2671.
• Meseguer M., Herrero J., Tejera A. et al. (2011) The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod., 26(10): 2658–2671.
• Meseguer M., Kruhne U., Laursen S. (2012) Full in vitro fertilization laboratory mechanization: toward robotic assisted reproduction? Fertil. Steril., Apr. 3 [Epub ahead of print].
• Olivennes F., Howies C.M., Borini A. et al. (2009) Individualizing FSH dose for assisted reproduction using a novel algorithm: the CONSORT study. Reprod. Biomed. Online, 218(2): 195–204.
• Penzias A.S. (2012) Recurrent IVF failure: other factors. Fertil. Steril., Mar. 28 [Epub ahead of print].
• Sudoma I., Goncharova Y., Zukin V. (2011) Optimization of cryocycles by using pinopode detection in patients with multiple implantation failure: preliminary report. Reprod. Biomed. Online, 22(6): 590–596.
• Tan B.K., Vandekerckhove P., Kennedy R., Keay S.D. (2005) Investigation and current management of recurrent IVF treatment failure in the UK. BJOG, 112(6): 773–780.
• Templeton A., Morris J.K. (1998) Reducing the risk of multiple births by transfer of two embryos after in vitro fertilization. N. Engl. J. Med., 339(9): 573–577.
• Theisen A. (2008) Microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH). Nature Education, 1(1) (www.nature.com/scitable/topicpage/microarray-based-comparative-genomic-hybridization-acgh-45432).
• Voullaire L., Wilton L., McBain J. et al. (2002) Chromosome abnormalities identified by comparative genomic hybridization in embryos from women with repeated implantation failure. Mol. Hum. Reprod., 8(11): 1035–1041.

Алина Жигунова,
фото автора