Нанозолото та нанопокриття із золота: стан наукових досліджень, перспективи застосування у медицині

50 років тому американський вчений-фізик, лауреат Нобелівської премії Річард Ф. Фейнман у грудні 1959 р. на щорічному засіданні Американського фізичного товариства прочитав лекцію на тему: «Внизу багато місця: запрошення увійти в нову галузь фізики» (There is plenty of room at the bottom: an invitation to enter a new field of physics) (Фейнман Р.Ф., 2002). Фактично з цього періоду людство задумалося над проблемою вивчення впливу на організм і навколишнє середовище надзвичайно малих частинок. Лекція Р.Ф. Фейнмана була першим кроком з науково- теоретичного обґрунтування доцільності досліджень з нанотехнологій, вивчення властивостей наночастинок та перспектив їх застосування у різних галузях діяльності людини, у тому числі в медичній практиці (Головин Ю.И., 2007; Мовчан Б.А., 2007; Москаленко В.Ф. та співавт., 2008; Розенфельд Л.Г. и соавт., 2008). До наночастинок відносяться фулерени, дендримери, ліпосоми, нанотрубки, квантові мітки, нанострижні, а також нанометали, в тому числі нанозолото (Thaxton C.S. et al., 2006; Гусев А.И., 2007; Чекман І.С., 2008; Чекман І.С. та співавт., 2008а, б; Baptista P. et al., 2008).

Наноструктуроване золото останнім часом привертає пильну увагу дослідників. Це пов’ язано з унікальними властивостями, які цей метал проявляє на рівні наночастинок. Такі властивості не характерні для макроскопічного золота і в основному пов’язані з великою кількістю поверхнево розташованих атомів, що зумовлено великим співвідношенням площі поверхні до об’ єму наночастинок. До цих властивостей відносять поверхневий плазмоновий резонанс, гігантське (підсилене поверхнево) раманівське розсіювання, високу каталітичну та хімічну активність. Серед різних напрямків застосування наноструктурованого золота особливе місце займає медицина. Зокрема, виконано багато наукових досліджень, присвячених методам діагностики, лікування, фармакологічним та цитологічним розробкам за допомогою нанозолота. Перш ніж перейти до цих методик, необхідно зупинитись на властивостях і типах наночастинок, які застосовуються у медицині.

Основні властивості наноструктурованого золота

Як відомо, наночастинки вияляють дещо інші властивості порівняно з макроскопічними об’єктами з тієї самої речовини. Не є винятком і наночастинки золота (НЧЗ) та нанопокриття із золота (НПЗ). Одна із основних властивостей нанозолота, яка застосовується для медичних цілей — поверхневий плазмоновий резонанс. Це явище пов’язане із взаємодією вільних електронів атомів наночастинки, які знаходяться на її поверхні, з електромагнітними хвилями. При цьому, залежно від частоти хвилі падаючого світла та коливань цих електронів, воно може відбиватися чи поглинатися. Наночастинки здатні відбивати світло з інтенсивністю, що на порядки перевищує інтенсивність випромінювання багатьох відомих барвників, які використовуються у діагностичних цілях, при цьому, на відміну від останніх, не спостерігається ефекту знебарвлення (Sönnichsen G., Alivisatos A.P., 2005). Це зумовлює інтенсивність і колір забарвлення колоїдних розчинів наночастинок золота (червоний, блакитний, фіолетовий). Водночас НЧЗ сильно поглинають хвилі з певною довжиною з подальшим перетворенням енергії світла у теплову. Довжина хвилі, при якій спостерігають поверхневий плазмоновий резонанс, значно залежить від форми, розмірів та хімічної природи наночастинок (Jain P.K. et al., 2006). Явище поверхневого плазмонового резонансу лежить в основі нової методики діагностики та лікування злоякісних пухлин (Huang X. et al., 2008).

Гігантське (поверхнево підсилене) раманівське розсіювання — ще одна специфічна властивість нанометалів. Воно властиве для молекул, сорбованих на поверхнях металічних наночастинок. Це означає, що у раманівському спектрі тієї чи іншої сполуки виявляється сильне підсилення сигналу в певних діапазонах довжин хвиль. Підсилення може сягати 10¹⁴–10¹⁵, а отже стає можливим виявляти дуже незначні кількості речовини, аж до окремих молекул. Механізм раманівського розсіювання остаточно нез’ ясований, вважається, що цей феномен пов’ язаний із нерівностями на поверхні металічних наночастинок, їх агрегацією, розташуванням молекули визначуваної речовини. Отже, гігантське раманівське розсіювання може і на сьогодні вже використовується у надточних методах визначення біологічно активних речовин в організмі людини.

Інша важлива властивість НЧЗ і НПЗ, на відміну від макроскопічних об’ єктів, — їх хімічна активність. Відомо, що золото нанорівня має високу спорідненість до тіолових (-SH) груп. Це відкриває широкі можливості для поєднання НЧЗ із різноманітними молекулами (в тому числі й макромолекулами) шляхом хімічної взаємодії з поверхнями наночастинок. Цей прийом отримав назву кон’ югації, а у разі приєднання біологічно активних сполук — біокон’ югації. НЧЗ можуть переносити специфічні розпізнавальні молекули (антитіла й антигени, ДНК, ферменти, біотин або стрептавідин тощо) і використовуватись у імунологічних та біохімічних дослідженнях, а також у лікуванні. Іноді, коли молекула не має тіолової групи, цю групу приєднують шляхом хімічного синтезу або генно- інженерними методами. У деяких випадках біомолекули приєднуються до поверхні НЧЗ не ковалентно, а шляхом електростатичних, гідрофільних та гідрофобних взаємодій (Huang X. et al., 2008).

Колоїдним розчинам НЧЗ властива агрегативна нестійкість, особливо у присутності іонів (Na⁺, К⁺ тощо). Для зменшення нестійкості загальноприйнятим є метод функціоналізації — покриття поверхні наночастинки хімічними речовинами з метою покращення її властивостей. Для функціоналізації використовують поверхнево активні речовини (натрію додецилсульфат, цетилтриметиламонію бромід, тетраметиламонію бромід), полімери — поліетиленгліколь, полістиренсульфонат, а також полі- L- глютамінову кислоту (Shim J.Y., Gupta V.K., 2007). Функціоналізовані НЧЗ зберігають агрегативну стійкість протягом кількох місяців (Huang X. et al., 2008).

Висока каталітична активність — ще одна властивість золота, яка проявляється на нанорівні. Вона пов’язана із наявністю великої кількості поверхневих атомів золота, які взаємодіють із субстратом. Запропоновано деякі методики, які використовують каталітичну активність НЧЗ. Золото у поєднанні з оксидом церію каталізує реакцію окиснення чадного газу у вуглекислий (Chen J. еt al., 2007). Не менш важливими є й електрохімічні властивості НЧЗ, які використовуються у низці методик у ролі елементів нанобіосенсорів.

Особливу увагу в контексті медичного застосування слід звернути на токсичність нанозолота. У ряді робіт зазначається, що НЧЗ мають низьку цитотоксичність (Son S.J. еt al., 2007) та високу біосумісність. Незважаючи на це, бракує досліджень щодо токсичності нанозолота in vivo, що має бути необхідним етапом перед клінічними випробуваннями препаратів на основі НЧЗ.

Наночастинки, які використовують у біомедичних дослідженнях

Як правило, використовують такі типи наночастинок: нанострижні (nanorods), наносфери (nanospheres), наноскоринки (nanoshells).

Нанострижні — це одновимірні наночастинки прямокутної форми із заокругленими кінцями та співвідношенням ширина/діаметр менш ніж 10 (Chen J. еt al., 2007). Для нанострижнів характерна найвища енергія плазмонового поля серед усіх інших НЧЗ, що й визначає їх застосування (Son S.J. еt al., 2007). У зв’язку із цим слід відмітити оптичні властивості нанострижнів. Вони мають два діапазони поглинання світлових хвиль: перший в ділянці ближнього інфрачервоного (ІЧ)- світла (800 нм), зумовлений поздовжніми коливаннями електронів плазмонового поля; другий — в ділянці 520 нм, зумовлений поперечними коливаннями, для якого відмічена порівняно менша інтенсивність. Поглинання ближнього ІЧ- світла залежить від співвідношення довжина/ ширина, що відкриває можливості оптичного «налагодження» нанострижнів під ту чи іншу довжину хвилі випромінюваного світла (Oyelere A.K. et al., 2007). Найбільш ефективними для медичних цілей є нанострижні з довжиною 17–70 нм (Huang X. et al., 2008).

Золоті наноскоринки — це новий тип оптично настроюваних наночастинок, що складаються з діелектричної серцевини, оточеної тонкою шкіркою з металічного срібла чи золота (Son S.J. et al., 2007). Їм, як і нанострижням, властивий поверхневий плазмоновий резонанс. Ці наноматеріали можуть використовувати у лікуванні як контрастні агенти. Оптимальний діаметр для медичних досліджень становить 50–100 нм із товщиною шару золота або срібла 4–8 нм.

Наносфери, як і наноскоринки, мають округлу форму, найбільш ефективний діаметр для них — 30–40 нм (Huang X. et al., 2008).

У медичних цілях можна використовувати й інші наночастинки — нанотрубки, наночастинки нерегулярної форми, а також нанопокриття. Останні застосовують у виробництві нанобіосенсорів та в деяких фармакологічних дослідженнях.

Нанозолото у діагностиці

Інтенсивні дослідження в галузі наномедицини сформували цілий окремий напрямок — нанодіагностику. Нанодіагностика — це застосування матеріалів, приладів або систем для клінічної діагностики, що мають нанорозміри. Згідно з результатами досліджень, проведених P. Baptista та співавторами (2008) і R.F. Service (2008), діагностика, заснована на НЧЗ, може мати три підходи:

1. Застосування властивості НЧЗ змінювати колір при агрегації. Найбільш досліджений приклад: функціоналізовані однонитковими ДНК наночастинки, здатні до специфічної гібридизації з комплементарними мішенями для визначення специфічних послідовностей.

2. Використання наночастинок у ролі «серцевини», вкритої специфічними функціональними групами або біомолекулами для забезпечення високоселективних «міток» для діагнозу.

3. Використання НЧЗ у електрохімічних методах, пов’язаних із осадженням металу для підсилення сигналу.

Перший підхід включає хімічне приєднання специфічних олігонуклеотидних послідовностей (як правило, тіол- модифікованих) до НЧЗ, комплементарних до фрагментів тих, які необхідно виявити у досліджуваному матеріалі. Зважаючи на значне співвідношення площі поверхні НЧЗ до об’ єму, ці структури можуть нести велику кількість таких послідовностей, підсилюючи чутливість методу. Хоча щільна функціоналізація молекулами ДНК пов’язана із низкою труднощів, J.S. Lee та співавторам (2009) вдалося досягти певного успіху, використовуючи наночастинки довжиною всього 2 нм. Гібридизація з комплементарними послідовностями приводить до агрегації наночастинок, і як наслідок — зміни оптичних властивостей колоїдного розчину, що їх містить. Це супроводжується зміною забарвлення, що може бути помічено неозброєним оком, а також зареєстровано спектрофотометрично. При незначних концентраціях визначуваної ДНК (порядку 10–15 моль), можливе застосування «срібного підсилення» (Thaxton C.S. et al., 2006; Hou S.Y. et al., 2007). Це означає, що НЧЗ, зв’ язані із визначуваною послідовністю і очищені від незв’ язаних, покриваються срібною плівкою шляхом відновлення іонів срібла у присутності гідрохінону чи інших відновників. Після нашарування такого покриття оптичний сигнал від наночастинок значно підсилюється.

Окрім цього, можливе визначення не однієї, а одразу кількох необхідних ДНК- послідовностей у матеріалі, чого неможливо досягнути традиційними методами. Ще одна перевага цього підходу — можливість визначення необхідних послідовностей в присутності інших, «непотрібних», із високою специфічністю.

Методика, заснована на агрегації НЧЗ, має ще одну перевагу: інтервал температури плавлення (тобто температури, при якій комплементарні зв’ язки розриваються) гібридизованих ДНК стає зовсім невеликим. Розрив комплементарних зв’ язків відбувається стрибкоподібно, змінюються й оптичні властивості розчину (зміна кольору, довжини хвилі, при якій спостерігається максимальне оптичне поглинання). При цьому сама температура плавлення сильно залежить від комплементарності, можна виявити неспівпадання одного або кількох нуклеотидів.

Простота, висока специфічність і чутливість роблять метод, заснований на НЧЗ, кон’ югованих із ДНК, перспективним у використанні в клінічній практиці. Завдяки виявленню специфічних маркерів хвороб (вірусних захворювань, злоякісних новоутворень тощо) без використання складних методик і дорого обладнання стає можливим діагностування патологій на ранній стадії, і, як наслідок — проведення ефективнішого лікування (Ding Y. et al., 2007).

Цей підхід може бути використаний для детекції інших специфічних маркерів, які не є нуклеїновими кислотами. Одним із них є розроблений J.S. Lee та співавторами (2008) метод визначення амінокислоти цистеїну, який, як відомо, є маркером деяких патологій. Для цього використовували золоті наночастинки діаметром порядку 20 нм, функціоналізовані комплементарними однонитковими ДНК з відомими послідовністями. До розчину з такими ДНК додавали сіль двовалентної ртуті, яка зв’ язувалася з тиміном, утворюючи тимінові димери між двома комплементарними ланцюгами, спричинюючи агрегацію наночастинок. У присутності цистеїну, який зв’ язував іони ртуті, тимінові димери зникали. При цьому спостерігали зміну кольору (фіолетовий — червоний), який можна було зареєструвати як неозброєним оком, так і на спектрофотометрі. Відомо, що комплекси ДНК із ртуттю стабільніші, ніж гібридизовані молекули без неї, і тому мають вищу температуру плавлення. Ця властивість і була використана при аналізі. Цей метод є чутливішим, ніж всі інші, й дозволяє виявляти концентрації цистеїну до 100 нмоль/л. Селективність була перевірена з іншими амінокислотами і виявлено, що навіть сірковмісний метіонін не здатен зв’ язувати двовалентну ртуть.

Ще одна методика, заснована на агрегації НЧЗ, — виявлення іншої амінокислоти — гомоцистеїну (Lim I.I. et al., 2007). Відомо, що присутність гомоцистеїну у концентраціях вище 15 мкмоль/л є маркером таких патологій, як хвороба Альцгеймера, остеопороз, серцево-судинні захворювання. Для кількісного виявлення гомоцистеїну у таких невеликих концентраціях використовують колоїдні розчини сферичних НЧЗ (середня довжина — 11,4 нм). Метод заснований на тому, що НЧЗ мають високу спорідненість до сульфгідрильних груп і таким чином реагують із гомоцистеїном. При цьому вони об’єднуються у кластери за рахунок утворення водневих зв’ язків між молекулами гомоцистеїну. Як наслідок змінюється оптичне поглинання розчину та його колір (червоний — блакитний). Як і в попередньому випадку, ці зміни можуть бути зареєстровані.

Як зазначалося вище, НЧЗ можуть бути кон’юговані із різноманітними специфічними розпізнавальними молекулами. Найчастіше ними є антитіла (деякі автори такі наночастинки називають «імунозолото»). Запропоновано цілу низку методик імуноаналізу із застосуванням таких кон’югатів. Слід відзначити дослідження X. Huang та співавторів (2007), які використали золоті нанострижні із співвідношенням довжина/ширина 3,9 та максимумом поглинання в ділянці ближнього ІЧ-світла у діагностиці епітеліальної карциноми. Для покращення стійкості й підвищення біосумісності нанострижні були оброблені полістиренсульфонатом, після чого нековалентно з’ єднані із специфічними антитілами до рецепторів епітеліального фактора росту. Як відомо, велика кількість таких рецепторів притаманна раковим клітинам епітеліальної карциноми. Завдяки оптичним властивостям НЧЗ були отримані чіткі зображення ракових клітин за допомогою темнопольної мікроскопії, а також досліджено раманівський спектр таких кон’югатів. Дослідники виявили, що НЧЗ рівномірно вкривають поверхню ракових клітин, спричиняючи появу сильних сигналів у раманівському спектрі, на відміну від нормальних клітин. Для підсилення раманівського розсіювання автори застосували поверхнево- активну речовину (ПАР) — цетилтриметиламонію бромід.

Інша методика діагностики злоякісних пухлин запропонована N.J. Durr та співавторами (2007). Цей метод базується на властивості НЧЗ змінювати колір до двохфотонної люмінесценції під дією Ті- сапфірового лазера. За допомогою цього методу були отримані чіткі тривимірні зображення ракових клітин, що знаходились на глибині до 75 мкм у розчині колагену, який імітував тканинне оточення. Окреме дослідження двохфотонної люмінесценції нанозолота проведене D. Bloemendal (2006). Z. Peng та співавтори (2007) розробили методику імуноаналізу людських антитіл, засновану на здатності НЧЗ гасити флюоресценцію деяких речовин. Автори методики отримали стабільний колоїдний розчин із наночастинками довжиною 15 нм за допомогою бичачого сироваткового альбуміну, додавши до нього баранячі анти-IgG до антитіл людини, які нековалентно приєднувалися до НЧЗ шляхом адсорбції та гідрофобних взаємодій. Після цього виготовили стандартні розчини визначуваного агента — IgG людини. Аналіз проводився у спеціальних камерах з полістирену з адсорбованими на дні антитілами баранячих анти-IgG. При додаванні всіх компонентів утворювався своєрідний сендвіч, на поверхні якого знаходилися баранячі анти-IgG, сорбовані на нанозолоті. Отримані розчини із імунокомплексами розбавляли та піддавали дії ультразвукових (УЗ)-хвиль, іонів та різного pH з метою дисоціації НЧЗ та антитіл. Після цього додавали флуоресцеїн — сильний нуклеофіл, що формував стабільні комплекси із НЧЗ, які гасили його флуоресцентний сигнал при дії світла з певною довжиною хвилі. Отже, чим більша концентрація НЧЗ, тим більше гасився сигнал, таким чином автори встановили залежність між концентрацією визначуваного антитіла та сигналом. Інтенсивність сигналу обернено пропорційно залежить від логарифма концентрації визначуваних антитіл. Границя визначення імуноаналізу становить 4,7 нг/мл і є нижчою за такі для традиційних імунологічних досліджень.

При застосуванні НЧЗ у діагностиці важливими є не тільки оптичні сигнали. Цікаве дослідження провели M. Eghtedari та співавтори (2007). Автори пропонують оптоакустичний метод у діагностиці раку. В основі методу лежить здатність НЧЗ під впливом ближнього ІЧ- світла виділяти тепло. Воно в свою чергу може передаватися оточуючим тканинам і перетворюватись у звукові хвилі, які можуть бути зареєстровані УЗ- приймачем. Таким чином дослідники поєднали високу селективність біокон’ югатів нанострижнів золота і антитіл та високу роздільну здатність УЗ- дослідження. Визначені оптимальні параметри нанострижнів для дослідження — ширина 15 нм та довжина 50 нм. Експерименти проводили на спеціальних лініях мишей. Вводили колоїдні розчини в пікомолярних концентраціях нанострижнів у фосфатному буфері шляхом підшкірних ін’єкцій. Для зниженшення токсичності зазвичай використовуваний при стабілізації цетилтриметиламонію бромід замінений на менш токсичні поліетиленгліколь і полі- 4- стиренсульфонат натрію. При опроміненні александритовим лазером, налаштованим на довжину хвилі, яка відповідає плазмоновому резонансу нанострижнів, реєстрували УЗ- сигнали. Вдалось отримати чіткі зображення локалізації наночастинок у тілі миші. Автори зазначають, що на відміну від методів, де реєструють оптичні сигнали, цей може бути застосований у діагностиці пухлин, розташованих глибоко в тілі. Окрім цього, він має перевагу перед традиційними методами (магнітно- резонансна томографія), тому що концентрації НЧЗ, необхідні для отримання зображень, у 75 разів нижчі за концентрації контрастних речовин, які використовують у магнітно-резонансній томографії.

Окрім антитіл, у ролі специфічних розпізнавальних біомолекул також використовують так звані аптамери. Аптамер — це олігонуклеотид (ДНК або РНК), який, подібно до антитіл, може специфічно зв’ язуватись із молекулою- мішенню (білок, поліпептид або окремий вірус чи клітина); їх ще називають біоштрих-кодами (bio barcode). У роботі P. He та співавторів (2007) використані аптамер- кон’ юговані НЧЗ у надчутливому методі виявлення тромбіну. Метод полягає у тому, що плазму крові або розчин тромбіну на мікропластинці змішували із кон’югатами. При цьому на поверхні пластинки знаходились іммобілізовані моно- або поліклональні антитіла до тромбіну. Таким чином тромбін потрапляв у так званий сендвіч між іммобілізованими антитілами та специфічними до нього аптамер-кон’югованими НЧЗ. Ці аптамери містять велику кількість аденіну, що й було використано для підсилення сигналу. Після очищення вищезазначених комплексів від надлишку реагентів їх обробили нуклеазами, внаслідок чого вивільнилася велика кількість вільного аденіну, що потім виявлявся електрохімічними методами. Завдяки тому, що НЧЗ можуть нести на собі значну кількість аптамерів, метод є дуже чутливим і дозволяє визначати тромбін у концентраціях порядку нг/мл. Перевагами такого аналізу також є його простота і селективність (жоден інший компонент крові не впливав на визначення, в тому числі й протромбін).

Ще один метод із застосуванням «біоштрих- кодів» розроблено J.A. Sioss та співавторами (2007). Для цього шляхом темплатного синтезу створили нанонитки, які складались із сегментів золота та срібла, та вкрили їх нанопокриттям із силіцію (кремнію), щоб уникнути окиснення. За допомогою сполуки сульфосукциніміділ- 4-(N- малеїмідометил) циклогексан- 1- карбоксилату (sulfosuccinimidyl 4- (N- maleimidomethyl)cyclohexane- 1- carboxylate — sulfo-SMCC) до таких нанотрубок приєднали тіол- модифіковану ДНК, специфічну до фрагментів послідовностей вірусів гепатиту В, С та імунодефіциту людини. Визначали інтенсивність флуоресценції за рахунок приєднаної до послідовностей оптичної мітки. Виявлено високу специфічність: ДНК- асоційовані нанотрубки погано гібридизували з послідовностями, які містили незначні неспівпадання (точкові мутації).

Золото нанорозмірів застосовують також для підсилення сигналу як вже існуючих біосенсорів, так і при створенні нових. Зокрема, Y. Ding та співавтори (2007) повідомляють про створення гібридних гідроксиапатит- золотих наночастинок для удосконалення вже створеного імуносенсору з кристалу кварцу. Їх робота заснована на п’ єзоефекті, цей пристрій має виключну чутливість, необхідну для проведення імунологічних досліджень. Однак застосування його на практиці обмежене у зв’язку з відсутністю оптимальної поверхні для приєднання максимальної кількості антитіл. Такою поверхнею стали гібридні наночастинки гідроксиапатиту та золота, функціоналізовані антитілами, специфічними до альфа- фетопротеїну, відомого як маркер гепатокарциноми. Гібридні частинки були хімічно приєднані до поверхні імуносенсору. Наявність визначуваного білка визначали за зміною частоти електричного струму внаслідок змін провідності на поверхні, що пов’ язано з утворенням імунокомплексів. Чутливість наносенсору виявилась високою (до десятків нг/мл, що є прийнятним результатом) і порівняною з традиційним методом хемілюмінісцентного імуноаналізу. Важливою також є відтворюваність сигналу, яка забезпечується процедурою регенерації — промиванням у розчинах сильних лугів та кислот.

Нанозолото використовують також для удосконалення інших електрохімічних методів. Так, створено новий метод точної детекції ДНК- послідовностей, заснований на електрохімічних вимірюваннях (Fu X.H., 2008). Для цього тіоловану однониткову ДНК-послідовність приєднали до поверхні золотого електрода. Після цього додали розчин, що містив комлементарну однониткову ДНК, ДНК з трьома неспівпаданнями та некомплементарну ДНК, які були приєднані до срібних наночастинок. Після гібридизації до них додавали буферний розчин із пероксидазою хріну. Вона, в свою чергу, також сорбувалася на срібних наночастинках. Електрохімічні вимірювання засновані на активності пероксидази — чим вона вища, тим сильніше падає напруга. Отже, за допомогою цього методу можна виявити комплементарні послідовності ДНК, а також точкові неспівпадання у них. Для підсилення сигналу у імунофлуоресцентному аналізі (Matveeva E. et al., 2007) використали острівцеві наноплівки із срібла (отримані відновленням срібла нітрату реактивом Толленса) та модифіковані срібні плівки з НПЗ товщиною 48 нм. Вважається, що підсилення сигналу спричинене локальним плазмоновим полем на поверхні наноплівок, яке підсилює збудження флюорофора і викликає сильнішу флуоресценцію. Дослідження проводили з кролячими антитілами та антитілами до них із приєднаною міткою, а також сорбованими на поверхні скла антитілами до міоглобіну, самим міоглобіном та вільними антитілами до нього (утворювалися структури типу сендвіч). В обох випадках срібна плівка значно підсилювала сигнал порівняно з невкритим склом, однак, ще більше підсилення спостерігали з плівкою, модифікованою НПЗ (підсилення сигналу у 50 разів порівняно з контролем і у 8 разів порівняно із срібною плівкою). Ця методика дозволяє визначати антигени і антитіла у концентраціях в сотні нг/мл.

Цікаве дослідження проведене A. Tripathi та співавторами (2007). Створено новий біосенсор для визначення глюкози у крові. Для цього запропонована методика, заснована на вимірюванні імпедансу у електрохімічному елементі, що становив собою НПЗ, осадженого на порах полікарбонатної мембрани (темплатний синтез), та властивостях білка кишкової палички — глюкозо-/галактозорецептора. Шляхом генної інженерії створено модифікований варіант білка, який містить залишки цистеїну, через сульфгідрильні групи яких білок приєднали до нанопор золота. При зв’язуванні субстрату білок змінював свою конформацію, згортаючись, зменшуючи тим самим площу вкритого ним поля (збільшувався ефективний діаметр нанопор), а це підвищувало провідність і зменшувало значення одного з компонентів імпедансу. Сама мембрана з нанопорами була під’ єднана до двох золотих електродів і результати вимірювань реєструвалися. Виведені формули для обчислення компонента імпедансу, який залежить від концентрації глюкози. Слід відзначити, що для досліджень застосовували концентрації у десятки мкмоль/л, і це свідчить про чутливість методу.

У іншій роботі (Wang X., Ozkan C.S., 2008) доповідається про cтворення нових наносенсорів на основі мультисегментних нанониток, які складаються із золота (середина нанонитки) та кадмію телуриду (кінці нанонитки). До них приєднали тіол-модифіковану однониткову ДНК з відомою послідовністю. Нанонитки синтезували шляхом темплатного синтезу (на алюмінієвій анодизованій мембрані). Достовірно встановлено, що при гібридизації з комплементарними ДНК у розчині електропровідність підвищується, а нанонитки поводять себе як польові транзистори. Такі наночастинки у подальшому можуть також бути використані для надточного виявлення інших біомолекул.

Y. Weizmann та співавторам (2008) вдалося здійснити синтез ієрархічної структури, що складалась із замкнених кільцевих однониткових ДНК. Структура нагадувала драбину, де «сходинки» були місцями комплементарного з’ єднання двох кільцевих молекул. До таких структур автори приєднували різні мітки: комплементарні до бокових ділянок («рейок драбини») молекули ДНК із флуоресцентною міткою, тромбін, мічений тетраметилродаміном, а також кон’югували їх із НЧЗ. Ці ієрархічні структури, як відзначають автори, потенційно можуть використовуватись як біосенсори. Наноциліндри із срібла та золота були використані G. Barbillion та співавторами (2008) для отримання наносенсорів, за допомогою яких виявляли стрептавідин (за рахунок стрепавідин- біотинової взаємодії). Сигналом наносенсорів був зсув довжини хвилі відбитого світла за рахунок ефекту Рамана. Встановлена залежність між цим зсувом та зміною концентрації стрептавідину. Відзначена висока чутливість отриманих наносенсорів (7 пкмоль для золотих та 600 фкмоль — для срібних) та афінність до субстрату. Ці наносенсори у найближчій перспективі можуть стати корисними у виявленні й інших біомолекул, зазначається у роботі.

Корисними НЧЗ можуть стати і в нанолітографії, тобто виробництві структур нанорозмірів, у яких хоча б один вимір становить не більше 100 нм. При цьому застосовують атомний силовий мікроскоп, наконечник якого виконує роль своєрідного пензля, наносячи на субстрат відповідну хімічну речовину. Дослідження B. Basnar та співавторів (2007) показує можливості ферментів як активаторів «наношаблонів» у нанолітографії. Зокрема, для цього застосували тирозиназу. Цей фермент окиснює тирамін у 3,4- дигідроксифенілаланін (ДОФА) із двома гідроксигрупами в ортоположенні. На силіцієвій поверхні, функціоналізованій C18, були хімічно приєднані молекули тираміну у необхідних місцях, щоб шар молекул сформував «шаблон» необхідної форми (це виконували методом нанолітографії із застосуванням атомного силового мікроскопа). Потім наносили розчин із тирозиназою, яка окиснювала тирамін. Для візуалізації використовували НЧЗ діаметром 9 нм, функціоналізовані бороновою кислотою (m-aminophenyl boronic acid). Кислота здатна хімічно взаємодіяти з ДОФА, тому НЧЗ приєднувались у місцях знаходження ДОФА. Метод виявляє нові можливості для конструювання нанобіосенсорів. M.Р. Johnsson та співавтори (2007) створили наносенсори на основі «підтримуючих ліпідних бішарів» (supported lipid bilayers, SLB). Наносенсор складався із тонкої слюдяної плівки з інкапсульованими в неї «нанодірками» — наночастинками золота чи срібла. На поверхню плівки наносили ліпідний бішар шляхом розриву ліпідних везикул. Досліджували інтенсивність локалізованого плазмонового резонансу отриманих сенсорів. Виявилося, що у фізіологічних умовах кращі властивості проявив сенсор з «нанодірками» золота. Ліпідний бішар, що вкриває плівку, може містити специфічні біомолекули для розпізнавання необхідних речовин, в тому числі, як зазначають автори, лікарських засобів (ЛЗ). Дослідники вивчали взаємодію біотин- функціоналізованих ліпідних бішарів з авідином та стрептавідином, зважаючи на їх високу спорідненість до біотину.

Перспективними є також роботи щодо створення та дослідження наносенсорів (Habrioux A. et al., 2007; Willner I. еt al., 2007; Medalsy I. еt al., 2008; Nordgren N. et al., 2008) та удосконалення мас- спектрометричного виявлення білків, так званого МАЛДІ — матрично- активованої лазерної десорбції/іонізації (Castellana E.T. et al, 2007). В основу МАЛДІ покладена дія лазерного випромінювання на матрицю з аналізованою речовиною з подальшою їх іонізацією.

Нанозолото у фармакотерапії захворювань

В основі методики лікування із застосуванням НЧЗ лежить явище поверхневого плазмонового резонансу. Як зазначалося вище, наночастинки здатні поглинати світло з певною довжиною хвилі і перетворювати його енергію у локалізоване тепло. При цьому виділяється велика кількість теплоти, спостерігається деструкція, утворення бульбашок (Norman R.S. et al., 2008). Якщо НЧЗ поєднати із специфічними до клітинних структур антитілами, то під дією джерела світла (лазер) клітини- мішені будуть руйнуватися. Золоті наночастинки, кон’юговані з моноклональними антитілами до антиепідермального ростового фактора, специфічно та рівномірно сполучаються із поверхнею ракових клітин з афінністю на 600% вищою, ніж для неракових клітин (Jain K.K., 2007). Фототермальна терапія застосовується в основному для лікування поверхневих злоякісних новоутворень (наприклад епітеліальної карциноми). Визначними щодо цього є роботи I.H. El-Sayed та співавторів (2006), X. Huang та співавторів (2006). Для того щоб світло, проходячи крізь біологічні тканини, не поглиналось і не шкодило здоровим клітинам, довжина його хвилі має бути оптимально налаштована. Форма та розміри НЧЗ також мають бути підігнані під заданий параметр, тобто їх плазмоновий резонанс має відповідати довжині випромінюваного світла. Дослідженнями встановлено, що для біологічних тканин найкраще застосовувати ближнє ІЧ- світло в ділянці 800 нм, оскільки воно погано поглинається ними. X. Huang і співавторами (2008) встановлені оптимальні параметри нанострижнів, наносфер та наноскоринок і методи їх функціоналізації, а P.K. Jain та співавторами (2006) проведені розрахунки ефективності поглинання та відбивання, а також резонансних хвиль для найчастіше використовуваних наночастинок: золотих наносфер, кремній- золотих наноскоринок та золотих нанострижнів. Як джерело ближнього ІЧ- світла використовують Ті- сапфіровий лазер, й не менш важливим аспектом є визначення порогової енергії для руйнування ракових клітин. У дослідженні X. Huang та співавторів (2006) наведена її величина — 10 Вт/м². Важливо, щоб порогова енергія була якомога нижчою для максимального зниження ймовірності шкідливого впливу на здорові клітини. Ще один важливий напрямок застосування фототермальної терапії — лікування інфекційних захворювань, спричинених мультирезистентними штамами мікрорганізмів. Так, кон’ юговані зі специфічними антитілами золоті нанострижні використовували у дослідженні бактерицидного впливу щодо синьогнійної палички (Norman R.S. et al., 2008).

Нанозолото у фармакологічних дослідженнях

НЧЗ та НПЗ активно застосовуються у дослідженнях ЛЗ. Зокрема проблемі біосумісності аморфних ЛЗ порівняно з кристалічними присвячена робота T. Wu та співавторів (2007). Вважається, що аморфні ЛЗ мають кращу біодоступність, ніж кристалічні, і можуть бути використані для доставки ЛЗ з обмеженою розчинністю, зокрема індометацину. Однак аморфні речовини схильні до поверхневої кристалізації, що спричинена наявністю на поверхні тонкої текучої плівки товщиною порядку 10 нм. Для її стабілізації аморфний індометацин вкрили нанозолотом товщиною 10 нм. Це, на думку авторів, має підвищити біодоступність медикаментів.

Окрім виявлення специфічних біомаркерів хвороб, нанозолото застосовують у визначенні ЛЗ у біологічних об’єктах. Так, E.E. Ferapontova та співавтори (2008) створили біосенсор для виявлення молекул теофіліну у сироватці крові. Він складається з молекули РНК-аптамеру, до якої приєднаний фероцен (мітка) з одного кінця, а іншим кінцем РНК приєднана тіоловими зв’ язками до золотого електрода. РНК-аптамер здатний високоспецифічно зв’язувати молекулу теофіліну, відрізняючи її від інших схожих метилксантинів. При зв’ язуванні з теофіліном РНК змінює свою конфомацію, внаслідок чого кінець із фероценом стає ближчим до поверхні електрода, змінюючи при цьому провідність. Відзначені висока чутливість і селективність біосенору. Запропонований метод аналізу придатний для визначення таких речовин, як дигоксин та солі ртуті (Hou S.Y.et al., 2007).

Нанозолото у цитологічних та цитогенетичних дослідженнях

За допомогою НЧЗ отримують чіткі зображення клітинних структур і досліджують їх функції. A.K. Oyelere та співавтори (2007) кон’ югували нанострижні золота з так званим NLS- пептидом (nuclear localization signal peptide), здатним специфічно зв’ язуватися з ядерними структурами. Отримано зображення ядер здорових та ракових клітин (плоскоклітинний рак), відмічено відмінності у раманівському спектрі НЧЗ у них. Автори вважають, що такі дослідження допоможуть у діагностиці ракових захворювань. Заслуговує на увагу дослідження G. Guigas та співавторів (2007). Автори вивчали еластичні властивості цитоплазми та нуклеоплазми за допомогою сферичних НЧЗ, мічених флуоресцентним декстрином і введених безпосередньо у клітину. Як відомо, дифузія речовин у цито- та нуклеоплазмі утруднена просторовими перешкодами, спричиненими наявністю розчинених у них високомолекулярних сполук (білки, вуглеводи, нуклеїнові кислоти). За допомогою флуоресцентної спектроскопії визначали рух НЧЗ і виявили, що просторові перешкоди у цитоплазмі сильніші, ніж у нуклеоплазмі, й у здорових клітин вони менші, ніж у ракових. Такі дослідження є важливими й для розуміння кінетики ЛЗ на рівні клітини. Інша важлива робота проведена J. Kneipp та співавторами (2007) і присвячена визначенню pH на субклітинному рівні. Для реалізації своєї мети дослідники створили біосенсор на основі пара- аміномеркаптобензойної кислоти, приєднаної до наноагрегатів золота. За допомогою вимірювань, заснованих на гігантському раманівському розсіянні та візуалізації даних, створили pH-карту клітини, на якій різними кольорами зображені зони із різним рН. Це також може стати в нагоді у дослідженнях закономірностей розповсюдження ЛЗ у клітині. Досягнення нанотехнологій роблять можливими операції на окремих клітинах. За допомогою атомного силового мікроскопу із наконечником, складеним із карбонових нанотрубок товщиною 20 нм із НПЗ на них, такі операції стають можливими (Vakarelski I. et al., 2007). Товщина нанотрубок дозволяє без пошкоджень клітинної мембрани проникати усередину клітини. НПЗ не тільки підвищує міцність, а й дозволяє приєднання різноманітних біологічно активних речовин, в тому числі й ЛЗ, та їх контрольоване введення в клітину. Квантові точки (НЧЗ невеликого розміру) використовують для отримання чітких тривимірних зображень компонентів клітини у цитологічних та цитогенетичних дослідженнях (Huo Q.A., 2007; Jain K.K., 2007). Нова методика оптичної мікроскопії запропонована C. Höppener та L. Novotny (2008). Вона отримала назву «ближньопольова оптична мікроскопія, заснована на використанні антени» (antenna-based near-field optical microscopy). Ключовим моментом у цій методиці, як випливає з назви, є застосування «антени», на кінчику якої знаходиться наносфера із золота, що слугує розсіювачем лазерних променів, випромінюваних з-під зразка. Наносфера при цьому не тільки значно збільшує детальність зображення, а й зменшує ефект знебарвлення флуоресцентних міток, використовуваних для аналізу. Як зразки, автори методики використовували ліпідні бішари еритроцитів, звільнені від спектрин- актинового каркасу. Вивчали локалізацію та щільність розміщення специфічних цитоплазматичних кальцієвих АТФаз. Дослідження саме кальцієвих АТФаз важливе для розуміння процесів, що проходять у мембрані еритроцитів при певних хворобах, пов’язаних із траснпортом кальцію (артеріальна гіпертензія, хвороби серця, хвороба Альцгеймера, серповидноклітинна анемія), та їх діагностиці. За допомогою НЧЗ розміром 3,9 нм M. Hu і співавтори (2008) покращили зображення 20S протеасоми мікобактерії туберкульозу. Вони вказують, що НЧЗ, функціоналізовані Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid — нікелева сіль нітрилоцтової кислоти), приєднувалися до специфічних ділянок, які містили гістидин і спричиняли вишикування протеасом у двовимірні масиви. Ця техніка дозволяє отримувати якісні зображення білків і може бути застосована і для інших білків. D.A. Giljohann та співавтори (2007) створили новий агент для трансфекції клітин — НЧЗ, функціоналізовані антисмисловими олігонуклеотидами. Відзначені висока здатність до проникнення у клітину, яку пояснюють попереднім зв’ язуванням із певними білками.

Методи синтезу НЧЗ та НПЗ

НЧЗ для біомедичних цілей синтезують, як правило, «вологим» (у розчині) способом. В основі цієї методики лежить реакція відновлення тетрахлораурат-іону, який утворюється при розчиненні золота у суміші концентрованих нітратної та хлористоводневої кислоти. У ролі відновників виступають натрію цитрат (так званий синтез за Туркевичем), натрію борогідрид у присутності ПАР (наприклад цетилтриметиламонію броміду) або полімерів — полівінілацетату (Pardiñas-Blanco I. et al., 2008), полівінілпіролідону. Внаслідок реакції відновлення утворюються НЧЗ, ріст яких контролюється ПАР (Smith D.K. et al., 2008). До того ж застосування ПАР дозволяє на виході отримати готові стабільні колоїдні розчини з функціоналізованими НЧЗ. Таким чином отримують нанострижні та наносфери золота. Поширеним також є синтез «на затравці». У ролі «затравки» виступають наночастинки срібла (порядку 1–4 нм у довжину), які сприяють утворенню НЧЗ із розчину тетрахлораурату при відновленні такими речовинами, як аскорбінова кислота і карбонат калію (Lu L. еt al., 2008). Для пришвидшення та полегшення синтезу НЧЗ R. Guo та співавтори (2007) використали полімер хітозан з адсорбованими на ньому молекулами етилендиамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) у спиртовому розчині. Відомо, що ЕДТА є хелатоутворювачем та відновником, що й було використано при відновленні тетрахлораурату з уворенням НЧЗ. Для синтезу нанотрубок та НПЗ широко використовують вищезазначений темплатний синтез на полікарбонатній чи алюмінієвій анодизованій мембрані з витравленими «доріжками», заснований на електрохімічному осадженні золота.

Для отримання НЧЗ необхідної форми дуже важливо контролювати параметри синтезу: концентрацію тетрахлораурату, відновника, ПАР, температуру та час реакції. Слід відмітити дослідження L. Zhang та співавторів (2007), які пропонують застосувати у якості стабілізуючого агента при синтезі НЧЗ апоферитин селезінки коня. Це білок, який складається із 24 звивистих пучків, що збираються у 12 нм структуру з порожниною діаметром 8 нм. У цій порожнині здатні накопичуватись іони заліза (ІІІ), які утворюються із заліза (ІІ) у реакції окиснення оксигеном, каталізовані самим апоферитином. До того ж апоферитин виступає як «шаблон» і пасивний агент у синтезі НЧЗ.

Основні проблеми впровадження НЧЗ та НПЗ у медичну практику

Незважаючи на перспективність досліджень НЧЗ та НПЗ у біомедичних цілях, їх впровадження у практичне застосування пов’язане із низкою труднощів. Перш за все відмічають проблему відтворюваності НЧЗ (Thaxton C.S. еt al., 2006), адже для промислового виробництва необхідно, щоб ці наноматеріали були однорідними, їх параметри не відрізнялися після кожного циклу синтезу. До того ж слід підвести виробництво НЧЗ під вимоги GMP (good manufacturing practice — належної виробничої практики). У лабораторних умовах НЧЗ отримують із застосуванням комерційних реактивів різної чистоти, і це також сильно впливає на параметри отриманих наноматеріалів (Smith D.K. et al., 2008). Біосумісність і токсичність накладають свої обмеження на методи хімічного синтезу. Зокрема, часто застосовуваний цетилтриметиламонію бромід є токсичним і тому має бути замінений на інший ПАР або полімер (наприклад натрій додецилсульфат чи полівінілпіролідон), якщо отримані наночастинки будуть вводитись в організм. Одним із найменш вивчених питань є токсикологічний аспект впровадження наночастинок золота у медичну практику. Бракує досліджень in vivo, не встановлено остаточного механізму проникнення НЧЗ всередину клітини та їх кумуляції в організмі (Banerji S.K., Hayes M.A., 2007; Чекман І.С. та співавт., 2008а, б).

Висновок

Таким чином, НЧЗ і НПЗ відкривають широкі перспективи впровадження препаратів цього металу у медичну практику. Їх успішно використовують для діагностики специфічних біомаркерів хвороб, виявлення ЛЗ, у цитологічних та цитогенетичних дослідженнях. Особливо слід відзначити можливості нанозолота у терапії ракових та інфекційних захворювань. Для біомедичних цілей в основному застосовують нанострижні, наносфери та наноскоринки золота. Ці наночастинки володіють унікальними оптичними, хімічними та фармакологічними властивостями. Однак існують і певні труднощі при впровадженні їх у практичну діяльність, пов’язані із проблемою відтворюваності, біологічними та токсикологічними аспектами. Незважаючи на це, у майбутньому можна сподіватись, що ці проблеми будуть вирішені, оскільки ці наноматеріали відкривають нові можливості у медицині, недосяжні для традиційних методів.

Адреса для листування:
Чекман Іван Сергійович
03057, Київ, просп. Перемоги, 34
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра фармакології та клінічної фармакології
E-mail: [email protected]

Посилання

• 1. Гусев А.И. (2007) Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. 2-е изд., испр., ФИЗМАТЛИТ, Москва, 416 с.
• 2. Головин Ю.И. (2007) Введение в нанотехнику. Машиностроение, Москва, 496 с.
• 3. Мовчан Б.А. (2007) Электронно-лучевая нанотехнология и новые материалы в медицине — первые шаги. Вісн. фармакології і фармації, 12: 5–13.
• 4. Москаленко В.Ф., Розенфельд л.Г., Мов­чан Б.О., Чекман І.С. (2008) Нанотехнології, наномедицина, нанофармакологія: стан, перспективи наукових досліджень, впровадження в медичну практику. В кн.: Человек и лекарство — Украина.
• 5. Матеріали І Національного конгресу, 26–28 березня 2008 р., Київ, с. 167–168.
• 6. Розенфельд л.Г., Дубок В.А., Брик А.Б, Шинкарук А.В. (2008) Биоактивный керамический нанокомпозит синтекость и перспективы его применения для пластики костной ткани. Мистецтво лікування, 50(4): 68–71.
• 7. Фейнман Р.Ф. (2002) Внизу полным полно места: приглашение в новый мир физики. Журн. Всесоюзн. хим. о-ва Рос. хим. журн., XLVI(5): 4–6.
• 8. Чекман І.С. (2008) Нанофармакологія: експериментально-клінічний аспект. Лік. справа. Врачеб. дело, 1097(3–4): 104–109.
• 9. Чекман І.С., Каплинський С.П., Небес­на т.Ю. терентьєв А.О. (2008а) Фармакологічний, токсикологічний і клінічний аспекти наномедицини. Фармакологія та лікарська токсикологія., 4(5): 3–9.
• 10. Чекман І.С., Корнєйкова Я.М., Загород­ний М.І., Кардаш М.І. (2008б) Квантові мітки: клінічні та фармакологічні аспекти. Мистецтво лікування, 50(4): 72–74.
• 11. Banerji S.K., Hayes M.A. (2007) Examination of nonendocytotic bulk transport of nanoparticles across phospholipid membranes. Langmuir., 23(6): 3305–3313.
• 12. Baptista P., Pereira E., Eaton P. et al. (2008) Gold nanoparticles for the development of clinical diagnosis methods. Anal. Bioanal. Chem., 391(3): 943–950.
• 13. Barbillon G., Bieon J.L., Bouillard J.S. (2008) Detection in near-feld domain of biomolecules ad-sorbed on a single metallic nanoparticle. J. Microsc., 229(Pt. 2): 270–274.
• 14. Basnar B., Xu J., Li D., Willner I. (2007) En-coded and enzyme-activated nanolithography of gold and magnetic nanoparticles on silicon. Langmuir., 23(5): 2293–2296.
• 15. Bloemendal D. (2006) Local feld spectroscopy by two photon luminescence microscopy. Optical Techniques Applied Physics, University of Twente, p. 4–9 (http://www.icfo.es/images/publications/MT06–001.pdf).
• 16. Castellana E.T., Russel D.H. (2007) Tailoring nanoparticle surface chemistry to enhance laser desorption ionization of peptides and proteins. Nano Lett., 7(10): 3023–3025.
• 17. Chen J., Wiley B.J., Xia Y. (2007) One-dimen-sional nanostructures of metals: large-scale synthesis and some potential applications. Langmuir., 23(8): 4120–4129.
• 18. Ding Y., Liu J., Wang H. et al. (2007) A piezoelectric immunosensor for the detection of α-fetoprotein using an interface of gold/hydroxyapatite hybrid nano-material. Biomaterials, 28(12): 2147–2154.
• 19. Durr N.J., Larson T., Smith D.K. et al. (2007) Two-photon luminescence imaging of cancer cells using molecularly targeted gold nanorods. Nano Lett, 7(4): 941–945.
• 20. Eghtedari M., Oraevsky A., Copland J.A. et al. (2007) High sensitivity of in vivo detection of gold nanorods using a laser optoacoustic imaging system. Nano Lett, 7(7): 1914–1918.
• 21. El­Sayed I.H., Huang X., El­Sayed M.A. (2006) Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles. Cancer Lett., 239(1): 129–135.
• 22. Ferapontova E.E., Olsen E.M., Gothelf K.M. (2008) An RNA aptamer-based electrochemical biosensor for detection of theophylline in serum. J. Am. Chem. Soc., 130(13): 4256–4258.
• 23. Fu X.H. (2008) Electrochemical measurement of DNA hybridization using nanosilver as label and horseradish peroxidase as enhancer. Bioprocess. Biosyst. Eng, 31: 69–73.
• 24. Giljohann D.A., Seferos D.S., Patel P.C. et al. (2007) Oligonucleotide loading determines cellular uptake of DNA-modifed gold nanoparticles. Nano Lett., 7(12): 3818–3821.
• 25. Guigas G., Kalla C., Weiss M. et al. (2007) Probing the nanoscale viscoelasticity of intracellular fuids in living cells. Biophys. J., 93(1): 316–323.
• 26. Guo R., Zhang L., Zhu Z., Jiang X. (2007) Direct facile approach to the fabrication of chitosan-gold hybrid nanospheres. Langmuir. 24(7): 3459–3464.
• 27. Habrioux A., Sibert E., Servat K. et al. (2007) Activity of platinum-gold alloys for glucose electrooxidation in biofuel cell. J. Phys. Chem. B., 111(34): 10329–10333.
• 28. He P., Shen L., Cao Y., Li D. (2007) Ultrasensitive electrochemical detection of proteins by amplifcation of aptamer-nanoparticle bio bar codes. Anal. Chem., 79(21): 8024–8029.
• 29. Huo Q.A. (2007) A perspective on bioconjugated nanoparticles and quantum dots. Colloids Surf. B Biointerfaces, 59(1): 1–10.
• 30. Höppener C., Novotny L. (2008) Antennabased optical imaging of single Ca2+ transmembrane proteins in liquids. Nano Lett., 8(2): 642–646.
• 31. Hou S.Y., Chen H.K., Cheng H.C., Huang C.Y. (2007) Development of zeptomole and attomolar de-tection sensitivity of biotin-peptide using a dot-blot goldnanoparticle immunoassay. Anal. Chem., 79(3): 980–985.
• 32. Hu M., Quian L., Briñas R.P. et al. (2008) Gold nanoparticle–protein arrays improve resolution for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol., 161: 83–91.
• 33. Huang X., El­Sayed I.H., Qian W., El­ Sayed M.A. (2006) Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. J. Am. Chem. Soc., 128(6): 2115–2120.
• 34. Huang X., El­Sayed I.H., Qian W., El­ Sayed M.A. (2007) Cancer cells assemble and align gold nanorods conjugated to antibodies to produce highly enhanced, sharp, and polarized surface raman spectra: a potential cancer diagnostic marker. Nano Lett., 7(6): 1591–1597.
• 35. Huang X., Jain P.K., El­Sayed I.H., El­ Sayed M.A. (2008) Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers. Med. Sci, 23(3): 217–228.
• 36. Jain K.K. (2007) Applications of nanobiotechnol-ogy in clinical diagnostics. Clin. Chem., 53(11): 2002–2009.
• 37. Jain P.K., Lee K.S., El­Sayed I.H., El­ Sayed M.A. (2006) Calculated absorption and scat-tering properties of gold nanoparticles of diferent size, shape, and composition: applications in biological imaging and biomedicine. J. Phys. Chem. B., 110(14): 7238–7248.
• 38. Johnsson M.Р., Jöhnsson P., Dahlin A.B., Höök F. (2007) Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Lett., 7(11): 3462–3468.
• 39. Kneipp J., Kneipp H., Wittig B., Kneipp К. (2007) One- and two-photon excited optical ph probing for cells using surface-enhanced raman and hyper-raman nanosensors. Nano Lett., 7(9): 2819–2823.
• 40. Lee J.S., Ulmann P.A., Han M.S., Mirkin C.A.(2008) A DNA-gold nanoparticle-based colorimetric competition assay for the detection of cysteine. Nano Lett., 8(2): 529–533.
• 41. Lee J.S., Seferos D.S., Giliohan D.A., Mir­kin C.A. (2009) Thermodynamically controlled separation of polyvalent 2-nm gold nanoparticle-oligonucleotide conjugates. J. Am. Chem. Soc., 30(16): 5430–5431.
• 42. Lim I.I., Ip W., Grew E. et al. (2007) Homocysteine-mediated reactivity and assembly of gold nanoparticles. Langmuir., 23(2): 826–833.
• 43. Lu L., Ai K., Ozaki Y. (2008) Environmentally friendly synthesis of highly monodisperse biocompatible gold nanoparticles with urchin-like shape. Langmuir., 24(3): 1058–1063.
• 44. Matveeva E., Gryczynski I., Barnett A. et al. (2007) Metal particle-enhanced fuorescent immunoassays on metal mirrors. Anal. Biochem., 363(2): 239–245.
• 45. Medalsy I., Dgany O., Sowwan M. (2008) SP1 protein-based nanostructures and arrays. Nano Lett., 8(2): 473–477.
• 46. Norman R.S., Stone J.W., Gole A. et al. (2008) Targeted photothermal lysis of the pathogenic bacteria, Pseudomonas aeruginosa, with gold nanorods. Nano Lett., 8(1): 302–306.
• 47. Nordgren N., Eklöf J., Zhou Q. et al. (2008) Top-down grafting of xyloglucan to gold monitored by QCM-D and AFM: enzymatic activity and interactions with cellulose. Biomacromolecules, 9(3): 942–948.
• 48. Oyelere A.K., Chen P.C., Huang X. et al. 2007) Peptide-conjugated gold nanorods for nuclear targeting. Bioconjug. Chem., 18(5): 1490–1497.
• 49. Pardiñas­Blanco I., Hoppe C.E., Piñeiro­ Redondo Y. et al. (2008) Formation of gold branched plates in diluted solutions of poly(vinylpyrrolidone) and their use for the fabrication of near-infrared-absorbing flms and coatings. Langmuir., 24(3): 983–990.
• 50. Peng Z., Chen Z., Jiang J. et al. (2007) A novel immunoassay based on the dissociation of immunocomplex and fuorescence quenching by gold nanoparticles. Anal. Chim. Acta, 583(1): 40–44.
• 51. Service R.F. (2008) Chemistry. DNA assembles materials from the ground up. Science, 319(5863): 558–559.
• 52. Shim J.Y., Gupta V.K. (2007) Reversible aggregation of gold nanoparticles induced by pH dependent conformational transitions of a self-assem-bled polypeptide. J. Colloid Interface Sci, 316(2): 977–983.
• 53. Sioss J.A., Stoermer R.L., Sha M.Y., Keat­ing C.D. (2007) Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis. Langmuir, 23(22): 11334–11341.
• 54. Smith D.K., Korgel B.A. (2008) The importance of the CTAB surfactant on the colloidal seed-mediated synthesis of gold nanorods. Langmuir., 24(3): 644–649.
• 55. Son S.J., Bai X., Lee S.B. (2007) Inorganic hollow nanoparticles and nanotubes in nanomedicine. Part 2: Imaging, diagnostic, and therapeutic applications. Drug Discov. Today, 12(15–16): 657–653.
• 56. Sönnichsen G., Alivisatos A.P. (2005) Gold nanorods as novel nonbleaching plasmon-based ori-entation sensors for polarized single-particle micros-copy. Nano Lett., 5(2): 301–304.
• 57. Thaxton C.S., Georganopoulou D.G., Mir­kin C.A. (2006) Gold nanoparticle probes for the de-tection of nucleic acid targets. Clin. Chim. Acta, 363(1–2): 120–126.
• 58. Tripathi A., Wang J., Luck L.A., Suni I.I. (2007) Nanobiosensor design utilizing a periplasmic E. coli receptor protein immobilized within Au/polycarbonate nanopores. Anal. Chem., 79(3): 1266–1270.
• 59. Vakarelski I.U., Brown S.C., Higashitani K., Moudgil B.M. (2007) Penetration of living cell mem-branes with fortifed carbon nanotube tips. Langmuir., 23(22): 10893–10896.
• 60. Wang X., Ozkan C.S. (2008) Multisegment nanowire sensors for the detection of DNA molecules. Nano Lett., 8(2): 398–404.
• 61. Weizmann Y., Braunschweig A.B., Wilner O.I. et al. (2008) A polycatenated DNA scafold for the one-step assembly of hierarchical nanostructures. Natl. Acad. Sci. USA., 105(14): 5289–5294.
• 62. Willner I., Basnar B., Willner B. (2007) Nanoparticle–enzyme hybrid systems for nanobiotechnology. FEBS J., 274(2): 302–309.
• 63. Wu T., Sun T., Li N. et al. (2007) Inhibiting surface crystallization of amorphous indomethacin by nanocoating. Langmuir, 23(9): 5148–5153.
• 64. Zhang L., Swift J., Butts C.A. et al. (2007) Structure and activity of apoferritin-stabilized gold nanoparticles. J. Inorg. Biochem., 101(11–12): 1719–1729.