Апоптоз нейтрофілів у хворих з гіпертензивною енцефалопатією

ВСТУП

Нейтрофіли беруть активну участь у патогенезі різних серцево- судинних захворювань. Функціональні особливості нейтрофілів, що характеризують їх високу мобільність, обсяги клітинної інфільтрації, цито- та гістотоксичний потенціал, визначають даний клітинний тип як цікавий об’єкт для наукових досліджень. Пріоритетність комплексного підходу в оцінці стану популяції нейтрофілів визначається відсутністю цілісної інформації про взаємозв’язок ключових подій у житті цих ефекторних клітин — міграції, продукції активних форм кисню (АФК), апоптозу, що пояснює труднощі визначення участі нейтрофілів у різних патологічних процесах (Сайгитов Р.Т., 2001; Пасечник А.В. и соавт., 2004).

Апоптоз привертає увагу дослідників як потенційний патогенетичний фактор при різних захворюваннях (Маянский А.Н. и соавт., 1999). Фактично цей вид загибелі клітин дозволяє видаляти потенційно небезпечні нейтрофіли з вогнищ запалення й сприяє їхньому обмеженню, оскільки фагоцитоз апоптозних клітин за допомогою резидентів-макрофагів виявляє імуносупресивний ефект (Маянский Н.А., 2002).

Апоптозна загибель клітин пов’язана з активацією каскаду апоптозних протеаз, названих каспазами. Сигнал загибелі передається всередину клітини через ряд адапторних білків, які організують комплекс з однією із ініціаторних каспаз — каспазою-8, що веде до активації останньої. Активна каспаза-8 сприяє включенню ефекторних каспаз, що завершують апоптозну програму (Weinmann P. et al., 1999). Враховуючи це, інгібування каспаз значно підвищує виживаність різних типів клітин, у тому числі нейтрофілів, за рахунок затримки апоптозу. Отже, вивчення рівня апоптозної загибелі гранулоцитів дозволить не тільки оцінити напруженість запальних реакцій при серцево-судинних захворюваннях, а й прогнозувати їхній перебіг.

Оскільки апоптоз — дуже складно регульований процес, то кількість сигнальних шляхів, ефекторних субстанцій і месенджерів, що беруть участь у цьому явищі, досить значна. Однією з таких речовин є оксид азоту (NO) (Bombeli T. et al., 1997).

Експресія індуцибельної NO-синтази, асоційованої з імунокомпетентними клітинами, може зумовлювати здатність NO виступати як фізіологічний регулятор або ж токсичний агент. Гранулоцитарний NO, що має вільнорадикальну природу, опосередковує свої ефекти через утворення активних форм при взаємодії із супероксидним аніон-радикалом або синглетним киснем (Estevez A.G. et al., 1999). У результаті дії активних метаболітів NO розвивається нітрозуючий стрес, що призводить разом з оксидативним стресом до ушкодження мембран клітин-мішеней, у тому числі кардіоміоцитів, і розвитку недостатності кровообігу.

Метою дослідження є вивчення особливостей функціонування нейтрофільних гранулоцитів при артеріальній гіпертензії (АГ) ІІ ступеня у хворих з гіпертензивною енцефалопатією (ГЕ).

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Обстежені 32 хворих з АГ 2-го ступеня та ГЕ віком 40–64 років (середній вік — 53,6±6,7 року). Тривалість захворювання становила 4–9 років (у середньому 6,5±2,2 року). У групу контролю ввійшли 23 практично здорових особи.

Виділення нейтрофілів периферичної крові проводили на подвійному градієнті щільності фіколу — урографіну. Ступінь функціональної активності нейтрофілів оцінювали за спонтанною люмінол- і люцигенінзалежною хемілюмінесценцією (ЛЛХЛ і ЛНХЛ), функціональний резерв клітин — за коефіцієнтами активації (КА) хемілюмінесценції (ХЛ), які розраховували як відношення стимульованого/активованого (а) показника — (аХЛ) до спонтанного (с) — (сХЛ). Як індуктор киснезалежного метаболізму нейтрофілів використали 1·109 суспензію вбитих нагріванням клітин Staphylococcus aureus штаму Р209. Потенціал системи антиоксидантного захисту плазми крові оцінювали за результатами ХЛ плазми, індукованої перекисом водню (ІХЛ).

Для аналізу продукції NO нейтрофільними гранулоцитами використали реактив Гріса. Виділені нейтрофіли ресуспендували в рідкому стерильному живильному середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% інактивованої фетальної телячої сироватки, 30 мкг L-глутаміну, 100 МО/мл пеніциліну й 100 мкг/мл стрептоміцину. Отриману суспензію клітин інкубували в 24-ямкових планшетах при температурі 37 °С протягом 6 год у зволоженій атмосфері з 5% вмістом вуглекислого газу. Сумарний вміст метаболітів NO у середовищі інкубації нейтрофілів визначали спектрофотометричним методом.

Рівень апоптозної готовності нейтрофілів визначали стрептавідин-біотиновим методом (реагенти фірми «DakoCytomation», Данія). Дослідження проводили у відповідності зі стандартним протоколом, визначаючи експресію маркера bak на поверхні мембран клітин. Розраховували апоптозний індекс (АІ) як співвідношення абсолютного числа апоптозних клітин до загальної кількості нейтрофілів у зразку.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою пакета прикладних програм Statistica 6.0. Перевіряли нормальність розподілу кількісних ознак з використанням критерію Шапіро — Уїлка, а також рівність генеральних дисперсій й однорідність розподілу. Для ознак, що мають розподіл, відмінний від нормального, обчислювали медіани й інтерквартильні інтервали. Дані в таблиці представлені у вигляді медіани, 25-го й 75-го квартилей — Ме (25%; 75%). Для порівняння двох незалежних груп за 1 ознакою застосовували критерій Манна — Уїтні. Для вивчення взаємозв’язку двох ознак використали кореляційний аналіз за Спірменом. Критичний рівень статистичної значимості вважали рівним 5%.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При порівняльному аналізі показників функціональної активності й апоптозної готовності нейтрофілів у хворих з АГ 2-го ступеня та ГЕ і в групі контролю виявлено ряд статистично значимих розходжень (таблиця).

Таблиця

Порівняльна характеристика показників функціональної активності й апоптозної готовності нейтрофілів у хворих з АГ 2-го ступеня та ГЕ і в групі контролю (Ме (25%; 75%))

У хворих з АГ 2-го ступеня та ГЕ нейтрофільні гранулоцити мали більш високий прооксидантний потенціал, що характеризується гіперпродукцією АФК (за даними сЛЛХЛ), і зокрема супероксидного аніон-радикала (сЛНХЛ), що є найбільш агресивним фактором ушкодження клітинних мембран. Посилення процесів киснезалежного метаболізму нейтрофілів супроводжувалося значним збільшенням їхніх резервних можливостей (аЛЛХЛ, КА ЛЛХЛ) порівняно з показниками контрольної групи. Одночасно спостерігалося зниження синтезу NO нейтрофілами. Зазначені зміни функціональної активності гранулоцитів мали місце на фоні зниження рівня їх апоптозної готовності.

Отримані дані свідчать про існування механізму ауторегуляції функцій нейтрофілів.

При кореляційному аналізі виявлений зворотний зв’язок між показниками синтезу гранулоцитарного NO і резервом продукції АФК нейтрофілами (Rs=  −0,38, p<0,001).

Отримані дані свідчать про досягнення нейтрофілами стану праймінгу, що супроводжується активацією вільнорадикальних реакцій, пов’язаних з утворенням АФК, які чинять цитотоксичну дію за допомогою ініціації процесів перекисного окиснення ліпідів клітинних мембран.

Біологічна суть явища праймінгу — в підготовці нейтрофілів до виконання їхніх функцій, і зокрема до реалізації киснезалежного фагоцитозу. На молекулярному рівні явище праймінгу включає 2 основні події: мобілізацію компонентів мембранозв’язаної НАДФН-оксидази, відповідальної за продукцію АФК фагоцитами, і експресію рецепторного апарату. Результатом цих процесів є збільшення функціонального резерву, що реалізується при наступній за праймінгом стимуляції нейтрофілів у вигляді більшої продукції біологічно активних сполук, у тому числі супероксидного аніон-радикалу, що є ключовою ланкою вільнорадикального ушкодження (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999).

Супероксиданіон у свою чергу впливає на метаболізм NO. Залежно від рівня супероксиданіону NO індукує нуклеарний фактор транскрипції kВ, що контролює синтез протизапальних цитокінів і запускає механізм активації генів запрограмованої смерті клітини, що призводить до апоптозу.

Індукція апоптозу імунних клітин — це механізм, що застосовує організм для купірування порушень в імунній системі. Експресія маркерів апоптозу на поверхні нейтрофілів необхідна для того, щоб обмежити імунну відповідь на запалення.

Отримані результати підтверджують дані інших досліджень, що вказують на існування механізмів ауторегуляторної діяльності нейтрофілів. Гранулоцитарний NO, очевидно, інгібує фагоцитарну НАДФ-оксидазу, в результаті чого знижується продукція вільних радикалів кисню.

Відомо, що при АГ порушується судинна реактивність до вазоактивних речовин. Основним механізмом даного феномену є продукція циклооксигеназозалежних простагландинів і вільних радикалів кисню, які знижують активність NO.

Співвідношення й кількісна характеристика циркулюючих нейрогуморальних факторів, пептидних факторів міжклітинної взаємодії, рівень механічного впливу на стінку судини визначають спрямованість змін у великих й резистивних артеріях при АГ. Із процесами апоптозу й проліферації тісно пов’язані місцеві запальні реакції й позаклітинний фіброз, що ведуть до зниження еластичних властивостей судин, прискорення атерогенезу, активації системи згортання крові і підвищення ризику серцево- судинних ускладнень у хворих на АГ (Шляхто Е.В., Моисеева О.М., 2002).

ВИСНОВКИ

Нейтрофіли периферичної крові у хворих з АГ 2-го ступеня та ГЕ перебувають у стані праймінгу, що характеризується високим біоцидним потенціалом клітин. Синтез NO як одного з факторів ауторегуляції, ймовірно, є захисним механізмом, спрямованим проти цитотоксичної дії фагоцитів. Стимуляція продукції гранулоцитарного NO може знижувати інтенсивність оксидативного стресу, лейкоцитарної агресії й стабілізації перебігу захворювання. Зниження апоптозної готовності свідчить про високі мобілізаційні можливості нейтрофілів й, очевидно, має компенсаторний характер. Висока реактивність гранулоцитів у системі гуморально-клітинної кооперації робить їх чутливим індикатором численних порушень гомеостазу й дає надію на нові можливості лікування АГ.

ЛІТЕРАТУРА

• Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. (1999) Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов. Успехи соврем. биол., 119(5): 462–475.
• Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И., Поздеев Н.М. (1999) Апоптоз нейтрофилов. Иммунология, 6: 11–19.
• Маянский Н.А. (2002) Каспазозависимый механизм апоптоза нейтрофилов: апоптогенный эффект туморнекротического фактора α. Иммунология, 23(1): 15–18.
• Пасечник А.В., Фролов В.А., Гвоздь Н.Г. и др. (2004) Апоптоз нейтрофилов как параметр воспалительной реакции при патологии различного генеза. Вестник РУДН, серия Медицина, 1(25): 103.
• Сайгитов Р.Т. (2001) Комплексный анализ миграции, эффекторной функции и апоптоза нейтрофилов. Автореф. дис. … канд. мед. наук. Москва, 30 с.
• Шляхто Е.В., Моисеева О.М. (2002) Клеточные аспекты ремоделирования сосудов при артериальной гипертензии. Артериальная гипертензия, 8(2): 32–37.
• Bombeli T., Karsan A., Tait J.F., Harlan J.M. (1997) Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulant. Blood, 89(7): 2429–2442.
• Estevez A.G., Spear N., Pelluffo H. et al. (1999) Examining apoptosis in cultured cells after exposure to nitric oxide and peroxynitrite. Methods Enzymol., 301: 393–402.
• Weinmann P., Gaehtgens P., Walzog B. (1999) Bcl-Xl- and Bax-alpha-mediated regulation of apoptosis of human neutrophils via caspase-3. Blood, 93(9): 3106–3115.

Адреса для листування:
Мурашко Наталія Костянтинівна
04112, Київ, вул. Дорогожицька, 9
Національна медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра неврології і рефлексотерапії