Моніторинг високоактивної антиретровірусної терапії ухворих на ВІЛ-інфекцію: значення вимірів рівнів неоптерину та β2- мікроглобуліну у сироватці крові

ВСТУП

Проведення етіотропної терапії — важлива складова в комплексі заходів надання медичної допомоги хворим на ВІЛ-інфекцію. Результати тривалих наукових досліджень дали підстави вважати, що для ефективного впливу на ВІЛ необхідне застосування етіотропних засобів з різними механізмами впливу на вірус водночас (Hoffmann C. et al. (Eds.), 2006; Chen L.F. et al., 2007). На сьогодні у всьому світі загальновизнаним стандартом лікування ВІЛ-інфекції як дорослих, так і дітей стала високоактивна антиретровірусна терапія (ВААРТ). Поряд з цим зазначено, що досягнення позитивного ефекту від ВААРТ можливе лише за умов її якісного моніторингу, який включає вірусологічний (визначення вірусного навантаження та резистентності ВІЛ), імунологічний (визначення рівня СD4+), клінічний (раннє виявлення та лікування опортуністичних інфекцій) контроль, а також контроль за побічними впливами антиретровірусних лікарських засобів (Hoffmann C. et al. (Eds.), 2006).

На жаль, сьогодні в Україні повний контроль за ВААРТ нездійсненний внаслідок відсутності сучасних високотехнологічних досліджень, які мають значну вартість. У зв’язку з цим пошук альтернативних методів адекватного контролю за ефективністю ВААРТ, які мають достатню інформативність і специфічність, але невисоку вартість, доступність для пацієнтів, а також можливість їх проведення в умовах невисокоспеціалізованих лабораторій виглядає актуальним та практично необхідним.

Серед таких альтернативних методів контролю можуть розглядатися визначення рівнів неоптерину (N) та β2- мікроглобуліну (β2-MG) у сироватці крові, які є достатньо інформативними серологічними маркерами активації Т- клітин (Fahey J.L. et al., 1990). Наведені в науковій літературі результати вже проведених досліджень свідчать, що підвищені рівні N та β2-МG є інформативними показниками ВІЛ-інфікованості серед груп ризику (Melmed R.N. et al., 1989; Bethea M., Forman D.T., 1990; Kramer A. et al., 1990), а також розвитку імуносупресії, летальності (Breustedt W. et al., 1989; Fuchs D. et al., 1989; Melmed R.N. et al., 1989; Hofmann B. et al., 1990; Kramer A. et al., 1990) та неврологічних ускладнень (Sonnerborg A.B. et al., 1989) у хворих з ВІЛ-інфекцією, які не отримували антиретровірусної терапії. Поряд з тим обмежена кількість досліджень не дає можливості зробити певних висновків про роль вимірювання рівнів N та β2-МG як маркерів оцінки ефективності етіотропної терапії ВІЛ-інфекції з застосуванням ВААРТ.

Мета дослідження — визначення ролі динамічних вимірів рівнів N та β2- МG у сироватці крові як маркерів ефективності ВААРТ та прогресування захворювання у пацієнтів з ВІЛ- інфекцію.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведено на клінічних базах обласного та міського СНІД-центрів міста Дніпропетровська. У всіх пацієнтів (батьків дітей) було отримано усну згоду на участь у дослідженні. Всі особи мали право вийти із дослідження без попередження дослідників та без пояснення причин.

Характеристика контингенту дослідження

У дослідженні взяли участь 93 особи віком від 3 до 58 років, яких залежно від ВІЛ- статусу та отримання ВААРТ було розподілено на 3 групи. До складу 1-ї групи увійшли 29 осіб, хворих на ВІЛ-інфекцію, які під час дослідження не отримували ВААРТ у зв’язку з відсутністю медичних показань або з будь-яких інших причин (ВІЛ без ВААРТ). До 2-ї групи увійшли 52 хворих на ВІЛ-інфекцію, які підлягали проведенню ВААРТ за медичними показаннями (ВІЛ з ВААРТ) та отримували її під час спостереження за однією з нижченаведених схем (табл. 1).

Таблиця 1

ВААРТ

До контрольної (3-ї) групи було включено 12 практично здорових осіб, які під час дослідження не переносили гострих інфекційних захворювань. Детальну характеристику груп наведено в табл. 2.

Таблиця 2

Характеристика груп дослідження

Усім хворим до початку дослідження було встановлено діагноз ВІЛ-інфекції, який ґрунтувався на визначенні сумарних антитіл до ВІЛ-1 у відповідний термін (для дітей) та був остаточно підтвердженим при повторних тестуваннях зразків у Національній референс- лабораторії з ВІЛ.

Клінічну стадію ВІЛ-інфекції хворого визначали відповідно до прийнятої в Україні класифікації ВІЛ- інфекції дорослих та дітей (ВООЗ, 2002) на підставі динамічного нагляду за станом пацієнта та визначенням у нього наявності, а також тяжкості будь-яких опортуністичних захворювань.

Дизайн дослідження

Це було відкрите порівняльне дослідження. Вимірювання рівнів N, β2-MG та CD4+ проводили на початку дослідження в усіх учасників та повторно через 1–2 міс у пацієнтів, які входили до 2-ї групи дослідження.

Методики лабораторних досліджень та інтерпретація результатів

Забір венозної крові для аналізу здійснювали шляхом венепункції з 8 до 10 годин ранку натще. Для визначення рівня CD4+ цільну кров в об’ємі 3 мл у дорослих та 1,5 мл у дітей відбирали до вакутайнера з ЕДТА, яку доставляли на аналіз в лабораторію при температурі 18–25 °С не пізніше ніж через 6 год після забору. Для визначення рівнів N та β2-MG цільну кров в об’ємі 5 мл у дорослих та 3 мл у дітей відбирали до чистої пробірки, після чого відділяли сироватку крові шляхом центрифугування, розміщували її в епіндорфи і заморожували при температурі 21 °С. У замороженому вигляді зразки доставляли до лабораторії.

Визначення рівнів N та β2-MG проводили за методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням стандартних тест-систем (для визначення N — «Neopterin ELISA», «ОRGENTEC Diagnostica GmbH», Німеччина та для визначення β2-MG — «β2- Microglobulin ORG 5 BM», «IBL- Hamburg GmbH», Німеччина). Отримані величини порівнювали з нормативами, наведеними виробниками.

Кількісне визначення субпопуляції Т-лімфоцитів (CD4+) у крові проводили методом проточної лазерної цитофлуорометрії з застосуванням моноклональних антитіл з подвійною міткою («IOTest Conjugated Antibodies», «Immunotech, Beckman Coulter Company», Франція). Вірогідною зміною (підвищенням чи зниженням) рівня CD4+ в динаміці вважали різницю, що становила 30% початкового рівня.

Статистична обробка

Статистичну обробку даних проводили непараметричними методами аналізу за допомогою комп’ютерної програми «Statistica+ 2005» (Ver. 3,5, Олексій Сімачов, 2005). Порівняння показників здійснювали за методами Манна — Уїтні (U) та Вілкоксона (Т), кореляційну залежність між показниками визначали за методом нормальної кореляції Пірсона (r) та Йєтса (χ2). Вірогідними вважали результати при p≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Усі 29 пацієнтів 1-ї та 12 осіб 3-ї груп повністю закінчили дослідження. Також всі 52 пацієнти 2-ї групи пройшли первинне обстеження (1-й візит), повторні забори крові (2-й візит) були проведені 35 пацієнтам цієї групи.

Аналіз даних свідчить, що у всіх здорових осіб рівні N та β2-MG коливались у межах від 0,98 до 5,22 нмоль/ л та від 0,8 до 3,0 мкг/ мл відповідно і не виходили за рамки референтних значень, встановлених виробниками тест-систем, що надає можливості їх використання для подальшого порівняльного аналізу.

Встановлено, що у 28 (96,6%) пацієнтів 1-ї та 50 (96,2%) 2-ї груп дослідження були підвищені рівні N, а підвищені значення β2-MG було визначено у 27 (93,1%) та у 45 (86,5%) хворих 1-ї та 2-ї дослідних груп відповідно. Результати порівняльного аналізу свідчать, що рівні N та β2-MG в сироватці крові пацієнтів 1-ї та 2-ї груп дослідження вірогідно переважають показники, зафіксовані в осіб групи контролю. Також визначено, що у пацієнтів 2-ї групи рівні N та β2-MG у сироватці крові вірогідно нижчі порівняно з 1-ю групою (рис. 1).

Аналіз залежності рівнів N і β2-MG у сироватці крові, з одного боку, і тривалості ВААРТ у пацієнтів 2-ї групи — з іншого, свідчить про вірогідний зворотний кореляційний взаємозв’язок між ними як для N, так і для β2-MG (рис. 2).

Проведене порівняння рівнів N та β2-MG, отриманих у динаміці у пацієнтів 2-ї групи, не виявило вірогідної різниці між ними (рис. 3).

Встановлено, що з 35 пацієнтів 2-ї групи протягом дослідження у 51,4% відбулося підвищення рівнів CD4+, у 14,2% — їх зниження, у решти — рівні CD4+ суттєво не змінилися. Нами не визначено залежності спрямованості змін рівнів як N, так і β2-MG від спрямованості змін рівнів CD4+ (рис. 4).

Як відомо, N та β2-MG є неспецифічними, але достатньо чутливими сироватковими маркерами активації імунної системи, яка відбувається і при ВІЛ-інфекції (Fahey J.L. et al., 1990). Результатами раніше проведених досліджень доведено, що прогресування ВІЛ-інфекції супроводжується підвищенням рівнів N та β2-MG у сироватці крові (Sher R., 1983–1984; Grieco M.H., et al., 1984; Calabrese L.H. et al., 1984–1985; Bagasra O. et al, 1988; Breustedt W. et al., 1989; Reddy M.M., Grieco M.H., 1989; Fahey J.L. et al., 1990), а застосування етіотропної монотерапії зидовудином приводить до зниження рівнів цих маркерів у хворих (Jacobson M.A. et al., 1989; Jacobson M.A. et al., 1991; Bass H.Z. et al., 1992). Залишається остаточно невизначеним вплив ВААРТ на динаміку рівнів N та β2-MG, а також значення їх динамічних вимірів у процесі лікування.

Результати представленого дослідження показали, що у групі хворих на ВІЛ- інфекцію, які отримують ВААРТ, в середньому рівень N вірогідно нижчий, ніж у хворих, які не отримують ВААРТ, що співпадає з даними проведеного раніше дослідження (Amirayan-Chevillard N. et al., 2000). Аналогічні результати отримані щодо β2-MG, проте нами не знайдено жодного повідомлення про вивчення впливу ВААРТ на динаміку рівня β2-MG при застосуванні ВААРТ. Ці дані можна розцінювати як позитивний ефект терапії та пояснювати зниженням вірусного навантаження ВІЛ-1, відновленням функції CD4+ , з одного боку, а також нормалізацією функціонування клітин-попередників під впливом ВААРТ — з іншого (Collier A.C. et al., 1996; Autran B. et al., 1997; Dam Nielsen S. et al., 1998; David D. et al., 1998).

Наведені в науковій літературі дані про значення вимірів рівнів N та β2-MG у сироватці крові як прогностичних маркерів рівнів CD4+ у хворих на ВІЛ-інфекцію показали суперечливі результати (Hofmann B. et al., 1990; Nordoy I. et al., 1996; Moore D.A. et al., 1998; Gaddi E. et al., 2000). У представленому дослідженні не визначено залежності змін рівнів СD4+ від ступеня і спрямованості (підвищення чи зниження) змін рівнів N та β2-MG в динаміці під впливом ВААРТ. Ці дані дають підставу вважати, що обидва маркери імунної активації не можуть відображати ступінь імуносупресії у хворих на ВІЛ- інфекцію і, ймовірніше за все, є незалежними факторами прогнозування перебігу захворювання.

За результатами нашого дослідженням встановлено, що протягом 1–2 міс спостереження у хворих на ВІЛ-інфекцію, які отримують ВААРТ, не відбувається суттєвих змін у рівнях N та β2-MG у сироватці крові. Попередні спостереження свідчать, що вірогідне зниження рівнів цих маркерів відзначали через 8–12 тиж при монотерапії зидовудином (Jacobson M.A. et al., 1989; Jacobson M.A. et al., 1991; Bass H.Z. et al., 1992), а нормалізацію рівня N — через 6 міс у більшості хворих, які отримували ВААРТ з використанням двох інгібіторів зворотної транскриптази та одного препарату групи інгібіторів протеази (Amirayan- Chevillard N. et al, 2000). Окрім того, нами визначено, що рівень як N, так і β2-MG має негативний кореляційний зв’язок з тривалістю проведення ВААРТ. Не виключено, що відсутність змін рівнів N та β2-MG під впливом ВААРТ, яка встановлена у нашому дослідженні, пов’язана, по-перше, з коротким терміном (1–2 міс) спостереження, по-друге, з тим, що більшість хворих до початку дослідження вже отримувала ВААРТ. Вартими уваги, на наш погляд, є дані невеликого дослідження французьких науковців, результати якого свідчать, що під впливом ВААРТ відбувається зниження рівня N в сироватці крові, а його значення корелюють зі ступенем вірусного навантаження ВІЛ (Amirayan-Chevillard N. et al., 2000).

Протягом спостереження нами зафіксовано 4 випадки загибелі хворих, 3 з яких — у групі пацієнтів, які не отримували ВААРТ, та 1 хворого, який лікувався ВААРТ. Встановлено, що в усіх 4 пацієнтів рівень N становив >100 нмоль/л у сироватці крові, тоді як серед пацієнтів, які протягом дослідження залишались живими, такий рівень N визначено лише в 1 випадку. Ці дані дають підстави вважати, що виміри рівнів N можуть адекватно віддзеркалювати глибину імуносупресії у хворих з ВІЛ-інфекцією в динаміці як природного перебігу захворювання, так і при проведенні ВААРТ та застосовуватись як предиктори летальності. Вважаємо, що проведення подальших досліджень з тривалим терміном спостереження (не менше 1 року) та включенням пацієнтів, які тільки розпочинають ВААРТ, а також проведення паралельного виміру рівнів CD4+, вірусного навантаження ВІЛ та клінічною оцінкою перебігу захворювання дозволять наблизитись до визначеності у питанні щодо ролі вимірів рівнів N та β2-MG у сироватці крові як маркерів ефективності ВААРТ та прогнозування перебігу захворювання.

ВИСНОВКИ

У хворих з ВІЛ-інфекцією, які отримують ВААРТ, середні рівні N та β2-MG нижчі, ніж у хворих з ВІЛ-інфекцією, які її не отримують.

У гетерогенній за тривалістю етіотропної терапії (0–26 міс) групі хворих з ВІЛ-інфекцією, які отримують ВААРТ, рівні N та β2-MG у сироватці крові, що вимірювали з інтервалом 1–2 міс, вірогідно не змінюються.

Динаміка рівнів як N, так і β2-MG впродовж 1–2 міс при проведенні ВААРТ не має вірогідної кореляції зі змінами рівнів СD4+.

Рівень N>100 нмоль/л у сироватці крові є достатньо чутливим передбачувальним маркером летальності хворих на ВІЛ.

При проведенні ВААРТ значення рівнів N та β2- MG мають зворотну залежність від її тривалості, що свідчить про позитивний вплив терапії та можливу прогностичну значущість вимірів цих білків у динаміці тривалого спостереження.

ЛІТЕРАТУРА

1. Amirayan-Chevillard N., Tissot-Dupont H., Obadia Y. et al. (2000) Highly active antiretroviral therapy (HAART) and circulating markers of immune activation: specific effect of HAART on neopterin. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7(5): 832–834.
2. Autran B., Carcelain G., Li T.S. et al. (1997) Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science, 277(5322): 112–116.
3. Bagasra O., Fitzharris J.W., Bagasra Т.R. (1988) Neopterin: an early marker of development of pre-AIDS conditions in HIV-seropositive individuals. Clin. Immunol. Newsletter, 9: 197–199.
4. Bass H.Z., Nishanian P., Hardy W.D. et al. (1992) Immune changes in HIV-1 infection: significant correlations and differences in serum markers and lymphoid phenotypic antigens. Clin. Immunol. Immunopathol., 64(1): 63–70.
5. Bethea M., Forman D.T. (1990) Beta 2-microglobulin: its significance and clinical usefulness. Ann. Clin. Lab. Sci., 20(3): 163–168.
6. Breustedt W., Rabe H., Volk D., Porstmann P. (1989) Neopterin — a prognostic marker in HIV infection. Dermatol. Monatsschr., 175(4): 226–231.
7. Calabrese L.H., Proffitt M.R., Gupta M.K. et al. (1984–1985) Serum beta 2-microglobulin and interferon in homosexual males: relationship to clinical findings and serologic status to the human T lymphotropic virus (HTLV-III). AIDS Res., 1(6): 423–438.
8. Chen L.F., Hoy J., Lewin S.R. (2007) Ten years of highly active antiretroviral therapy for HIV infection. Med. J. Aust., 186(3): 146–151.
9. Collier A.C., Coombs R.W., Schoenfeld D.A. et al. (1996) Treatment of human immunodeficiency virus infection with saquinavir, zidovudine, and zalcitabine. AIDS Clinical Trials Group. N. Engl. J. Med., 334(16): 1011–1017.
10. Dam Nielsen S., Kjaer Ersboll A., Mathiesen L. et al. (1998) Highly active antiretroviral therapy normalizes the function of progenitor cells in human immunodeficiency virus-infected patients. J. Infect. Dis., 178(5): 1299–1305.
11. David D., Bani L., Moreau J.L. et al. (1998) Regulatory dysfunction of the interleukin-2 receptor during HIV infection and the impact of triple combination therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95(19): 11348–11353.
12. Fahey J.L., Taylor J.M., Detels R. et al. (1990) The prognostic value of cellular and serologic markers in infection with human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med., 322(13): 166–172.
13. Fuchs D., Spira T.J., Hausen A. et al. (1989) Neopterin as a predictive marker for disease progression in human immunodeficiency virus type 1 infection. Clin. Chem., 35(8): 1746–1749.
14. Gaddi E., Laucella S., Balbaryski J. et al. (2000) Prognostic value of soluble intercellular adhesion molecule-1 (s-ICAM-1) in HIV-infected children. Scand. J. Immunol., 52(6): 628–633.
15. Grieco M.H., Reddy M.M., Kothari H.B. et al. (1984) Elevated beta 2-microglobulin and lysozyme levels in patients with acquired immune deficiency syndrome. Clin. Immunol. Immunopathol., 32(2): 174–184.
16. Hoffmann C., Rockstroh J.K., Kamps B.S. (Eds.) (2006) HIV-medicine 2006. Flying Publisher, Paris, 826 p.
17. Hofmann B., Wang Y.X., Cumberland W.G. et al. (1990) Serum beta 2-microglobulin level increases in HIV infection: relation to seroconversion, CD4 T-cell fall and prognosis. AIDS, 4(3): 207–214.
18. Jacobson M.A., Abrams D.I., Volberding P.A. et al. (1989) Serum beta 2-microglobulin decreases in patients with AIDS or ARC treated with azidothymidine. J. Infect. Dis., 159(6): 1029–1036.
19. Jacobson M.A., Bacchetti P., Kolokathis A. et al. (1991) Surrogate markers for survival in patients with AIDS and AIDS related complex treated with zidovudine. BMJ, 302(6768): 74–78.
20. Kramer A., Biggar R.J., Goedert J.J. (1990) Markers of risk in HIV-1. N. Engl. J. Med., 322(26):1886.
21. Melmed R.N., Taylor J.M., Detels R. et al. (1989) Serum neopterin changes in HIV-infected subjects: indicator of significant pathology, CD4 T cell changes, and the development of AIDS. J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 2(1): 70–76.
22. Moore D.A., Henderson D., Gotch F., Gazzard B. (1998) Reversal of abnormalities of neutrophil adhesion molecule expression in HIV infection following protease inhibitor therapy. AIDS, 12(15): 2083–2084.
23. Nordoy I., Aukrust P., Muller F., Froland S.S. (1996) Abnormal levels of circulating adhesion molecules in HIV-1 infection with characteristic alterations in opportunistic infections. Clin. Immunol. Immunopathol., 81(1): 16–21.
24. Reddy M.M., Grieco M.H. (1989) Neopterin and alpha and beta interleukin-1 levels in sera of patients with human immunodeficiency virus infection. J. Clin. Microbiol., 27(9): 1919–1923.
25. Sher R. (1983–1984) Beta 2-microglobulin levels in homosexual men in Johannesburg, South Africa. AIDS Res., 1(4): 271–274.
26. Sonnerborg A.B., von Stedingk L.V., Hansson L.O., Strannegård O.O. (1989) Elevated neopterin and beta 2-microglobulin levels in blood and cerebrospinal fluid occur early in HIV-1 infection. AIDS, 3(5): 277–283.

Адреса для листування:
Шостакович-Корецька Людмила Романівна
49044, Дніпропетровськ, вул. Дзержинського, 9
Дніпропетровська державна медична академія,
кафедра факультетської педіатрії та дитячих інфекційних хвороб
E-mail: [email protected]