Протефлазід^® vs COVID-19: успіхи досліджень

Вступ

Коронавірусна інфекція заявила про свою актуальність ще на початку 2000-х років. У 2013 р. опубліковано статтю, присвячену цій темі, — «Коронавірус: проблеми та перспективи», в якій підкреслено реальну загрозу інфекції для людства [1].

Лікарський засіб Протефлазід^® — етанольний екстракт з рослинної сировини — зелених частин диких злакових рослин сімейства Gramineae, родин Calamagrostis Adans і Deschampsia Beauv, який містить біологічно активні речовини поліфармакологічної дії. Діючі речовини (активні фармацевтичні інгредієнти — АФІ) препарату Протефлазід^® — флавоноїдні з’єднання агліконів: трицин, апігенін, лютеолін. Діючими молекулярними речовинами АФІ Протефлазід^® є флавони та флавоноїди, що утворюють комплекси: [трицин, трицин-7-О або 8-С глікозид]: [лютеолін-7-О або 8-С глікозид]: [апігенін, апігенін-7-О або 8-С глікозид] в «матриці» допоміжних речовин: амінокислот; карбонових кислот і цукрів; полісахаридів, пектинів, хлорофілів (a і b) та геміцелюлози (А і В). Лікарська форма: краплі. Фармакотерапевтична група: противірусні засоби прямої дії. Код АТХ: J05A X [2–4].

Сучасні доклінічні дослідження вивчення специфічної противірусної активності препарату Протефлазід^® щодо РНК-вмісних коронавірусів, в тому числі SARS-CoV-2

Властивість препарату Протефлазід^® блокувати розмноження РНК- та ДНК-вірусів (за рахунок інгібування РНК- та ДНК-полімераз) встановлена 15 років тому та стала основою для тео­ретичного обґрунтування спроби дослідити діючу речовину препарату на його можливу противірусну активність проти коронавірусів у доклінічних дослідженнях [5–7].

Відомо, що активними мішенями для противірусних препаратів проти коронавірусу SARS-CoV-2 можуть бути РНК-полімераза, 3СL-протеаза та транскрипційний фактор Nrf2. У роботах зарубіжних та українських науковців ще на початку 2020 р. було показано, що флавоноїди інгібують активність 3СL-протеази та зв’язують ангіотензинперетворювальний фермент 2-го типу (angiotensin converting enzyme 2 — АСЕ2), який працює як рецептор коронавірусного поверхневого глікопротеїну вірусних шипиків (spike glycoprotein), крім того, активація транскрипційного фактора Nrf2 сприяє зниженню розвитку оксидативного стресу та запалення [8–26].

На початку 2020 р. методом молекулярного докінгу встановлено, що ліганд добре розташовується в каталітичній кишені 3CL-протеази, утворюючи водневі зв’язки із залишками Ser 144, Gly 143, розташовуючись між каталітичними залишками His 163, Asn 142 та Cys 145 і, таким чином, утворює двома гідроксилами катехолу водневі зв’язки із залишком Glu 166 [6, 9].

У Саарландському університеті (University of Saarland), Німеччина, проведені дослідження з визначення таргетного інгібування активності 3CL-протеази коронавірусу SARS-CoV-2 препаратом Протефлазід^® та встановлено, що він має високий потенціал пригнічувати активність 3CL-протеази коронавірусу SARS-CoV-2 [27].

Матеріали дослідницької експериментальної роботи спеціалістів ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України» показали, що Протефлазід^® виявляє високу противірусну активність in vitro на моделі з використанням коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, інгібуючи розмноження РНК-вмісного коронавірусу (ефективність підтверджена на двох культурах клітин; пригнічення на 6 логарифмів), який подібний за структурою до коронавірусу людини [6].

Дослідження українських вчених підтверджені на моделях респіраторного коронавірусу людини HCoV 229E у відділі експериментальної вірусології Ганноверської медичної школи (Німеччина) та SARS-CoV-2 в лабораторії BSL3 CReSA Дослідницького центру здоров’я тварин Автономного університету Барселони (Іспанія) з ізолятом коронавірусу тяжкого гострого респіраторного синдрому SARS-CoV-2, а також в Національній лабораторії у Галвестонi (США).

Визначення противірусної дії препарату Протефлазід^® виконано на перещеплюваній моношаровій культурі клітин Vero E6 (ATCC CRL-1586) кількісним люмінесцентним біоаналітичним методом на основі подвійної системи люцифераз. Для виключення неспецифічної цитотоксичної дії спирту на культуру клітин Vero E6, який є розчинником препарату, при дослідженнях з респіраторним коронавірусом людини HCoV 229E (Німеччина), спирт був видалений випаровуванням, а сухий залишок стабілізували 1% DMSO. Контроль за кількісним та якісним станом препарату після видалення спирту виконали методом високороздільної рідинної хроматографії (LC-MS). При дослідженні серії розведень безспиртової субстанції препарату Протефлазід^® (5,3–0,1 мкг/мл) встановлено, що при концентрації 1,0 мкг/мл відбувається інгібування реплікації коронавірусу HCoV 229E на 92% за відсутності цитотоксичності препарату для культури клітин Vero E6. Підвищення концентрації препарату до 5,3 мкг/мл викликало 100% інгібіцію реплікації вірусу HCoV 229E [27].

У Центрі досліджень здоров’я тварин (IRTA-CreSA, Автономний університет Барселона, Іспанія) досліджена специфічна противірусна активність препарату Протефлазід^® проти коронавірусу SARS-CoV-2 in vitro на культурі клітин Vero E6. Препарат Протефлазід^®, краплі, в серії послідовних розведень в діапазоні 0,0000819–160 мкг вносили в культуру клітин Vero E6 з одночасним інфікуванням вірусом SARS-CoV-2 в інфікуючій дозі TCID50/мл 101,8 з подальшою інкубацією. Вірусне інфікування оцінювали мікроскопічно на підставі клітинного цитотоксичного ефекту. Протефлазід^® виявляв високу противірусну активність щодо вірусу SARS-CoV-2 в діапазоні концентрацій 1,28–6,4 мкг [33].

Дослідженнями американських вчених Національної лабораторії у Галвестонi, яка спеціалізується на дослідженнях вірусів SARS/MERS/COVID-19, Департаменту мікробіології та імунології Центру біозахисту та нових хвороб (Національна лабораторія Галвестона, Медичний факультет Техаського університету, Галвестон, США) в умовах in vitro на клітинних культурах нирок африканської зеленої мавпи (Vero E6) та клітинах легеневої аденокарциноми людини з рецептором АСЕ2 (A549/ACE2) продемонстрована здатність препарату Протефлазід^® попереджувати вірус-індукований цитопатичний ефект, викликаний SARS-CoV-2 (USA-WA-1/2020 isolate), та надавати 100% противірусний захист від ураження клітин вірусом SARS-CoV-2 [28].

Наявні наукові дослідження, виконані в зарубіжних лабораторіях, підтверджують, що флавоноїди (апігенін, лютеолін, кверцетин) активують транскрипційний фактор Nrf2, завдяки чому знижують експресію рецепторів АСЕ2 в респіраторних епітеліальних клітинах, чим перешкоджають проникненню вірусу в клітини епітелію та блокують розмноження вірусу SARS-CoV-2. Активація транскрипційного фактора Nrf2 дає можливість попереджувати або знижувати тяжкість перенесення організмом навантаження вірусом SARS-CoV-2, захищаючи клітини організму від оксидативного стресу та запалення, сприяючи зниженню вірогідності виникнення гострого респіраторного дистрес-синдрому [12, 15, 17, 20–22].

Відомо, що підвищене утворення так званих реактивних форм кисню (Reactive oxygen species — ROS) у поєднанні з оксидативним стресом при тяжких формах COVID-19 призводить до цитокінового шторму. У разі COVID-19 прозапальні цитокіни та ROS діють спільно і активують епітеліальні та ендотеліальні клітини легень, що підвищує проникність міжклітинного простору клітин легень і, як наслідок, сприяє відтоку в альвеоли ексудату, який накопичується та призводить до суттєвого порушення газообміну в легенях. У свою чергу, цитокіновий шторм та оксидативний стрес зумовлюють ROS-залежний апоптоз ендотеліальних клітин, який вносить свою частку у вивільнення факторів коагуляції і, як наслідок, — тромбоутворення.

Наразі ТОВ «Науково-виробнича компанія «Екофарм» разом із науковими партнерами активно вивчає дію лікарського засобу Протефлазід^® на транскрипційний фактор Nrf2. Про результати досліджень можна буде дізнатися у відповідних наукових публікаціях.

Протефлазід^®, краплі, — противірусний засіб прямої дії, механізм якої при гострому респіраторному вірусному захворюванні COVID-19 зумовлений:

• блокуванням активності 3СL-протеази, життєво важливої для проникнення та розмноження вірусу SARS-CoV-2;
• блокуванням РНК-полімерази, необхідної для реплікації вірусу SARS-CoV-2.

На основі даних доклінічних досліджень ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України», Інститут молекулярної біології і генетики Національної академії наук України та Український центр наукової медичної інформації та патентно-ліцензійної роботи Міністерства охорони здоров’я (МОЗ) України опублікували Інформаційний лист про нововведення в сфері охорони здоров’я «Антивірусна активність флавоноїдного препарату Протефлазід^®» та розіслали адресно міським та обласним управлінням охорони здоров’я України [29].

Звіти з проведених доклінічних досліджень щодо специфічної противірусної активності препарату Протефлазід^® при SARS-CoV-2 сформовані у вигляді доповнення до реєстраційних матеріалів на лікарський засіб Протефлазід^®, краплі, та передані на спеціалізовану експертизу до МОЗ України. Наказом МОЗ України від 06.08.2021 р. № 1680 до інструкції для медичного застосування препарату Протефлазід^®, краплі, в розділ «Фармакодинаміка» внесено зміни (виділено підкресленням):

«Доведено, що механізм прямої противірусної дії полягає в інгібуванні вірусоспецифічних ферментів — ДНК- та РНК-полімераз, тимідинкінази, зворотної транскриптази, 3СL-протеази та ней­рамінідази. Протефлазід^® пригнічує активність 3CL-протеази коронавірусу SARS-CoV-2, що підтверджено методом молекулярного докінгу та при використанні набору для аналізу, який містить 3CL-протеазу з міткою МBP (мальтозозв’язуючий білок коронавірусу SARS-CoV-2). Методом подвійного аналізу гена-репортера люциферази Renilla (відтворює реплікацію сезонного коронавірусу CoV-229E) показано, що препарат її блокує. У доклінічних дослідженнях in vitro на культурах клітин мавпи (Vero E6) та людини (А549/АСЕ2) показана противірусна активність препарату проти пандемічного коронавірусу людини SARS-CoV-2 — зі значним пригніченням реплікації вірусу» [4].

Наказом МОЗ України від 10.09.2021 р. № 1922 аналогічні зміни внесено також в інструкцію для медичного застосування лікарського засобу Флавовір^®, сироп [30]. Це особливо важливо, оскільки, за прогнозами зарубіжних та вітчизняних фахівців, в епідеміологічному сезоні 2021–2022 рр. коронавірус SARS-CoV-2 та його сьогоденні «мутанти» становитимуть особливу небезпеку для осіб дитячого віку.

Ретроспективні пілотні клінічні спостереження

ТОВ «Науково-виробнича компанія «Екофарм» ще з лютого 2020 р., до початку оголошення Всесвітньою організацією охорони здоров’я пандемії COVID-19, ініціювала власну гуманітарну акцію для захисту медичного персоналу клінік, які приймали пацієнтів, інфікованих SARS-CoV-2, та безкоштовно надала понад 30 тис. флаконів препарату Протефлазід^®, краплі, більше ніж 140 лікарням, що брали участь у наданні медичної допомоги хворим на COVID-19.

Обсяги благодійної допомоги та звіти, що надійшли від медичних закладів, дозволили узагальнити досвід профілактичного та лікувального застосування препарату Протефлазід^®. Національною академією статистики, обліку та аудиту проаналізовано листи-звіти про застосування препарату Протефлазід^® від 79 медичних установ з різних регіонів України. Початок прийому лікарського засобу медичними працівниками та пацієнтами — 27.02.2020 р. Кінцева інформація — 01.10.2020 р. [31].

У більшості листів від медичних установ зазначено, що медичний персонал контактував з потенційно хворими на COVID-19 та мав високий ризик інфікування зазначеною коронавірусною інфекцією.

Загальна кількість осіб, що приймали препарат Протефлазід^® в зазначений період з профілактичною метою, становила 8572, в тому числі 7444 медичні працівники та 1128 пацієнтів. Загальна кількість осіб, що приймали Протефлазід^® з лікувальною метою, становила 433. Загальна кількість медичного персоналу та пацієнтів, які застосовували препарат Протефлазід^®, краплі, з метою профілактики та лікування, — 9005. Статистичний показник «Кількість летальних випадків» серед медичних закладів, які надали таку інформацію, становить «0».

У цілому порівняно з офіційними даними щодо COVID-19 серед осіб, які застосовували Протефлазід^®:

• відсутня смертність;
• в медичних установах зменшилася частка хворого медичного персоналу у 2,2 раза;
• зменшилася частка пацієнтів із тяжким перебігом хвороби у 3,3 раза;
• скоротився середній термін лікування у 1,8 раза [2, 31].

Можна припустити, що статистичні дані щодо захворюваності та смертності медичних працівників та пацієнтів від СOVID-19 в Україні могли би бути значно оптимістичнішими у випадку своєчасного та широкого застосування препарату Протефлазід^® на амбулаторному етапі.

Фахові спеціалісти НАМН України, після ознайомлення з результатами проведених доклінічних досліджень та клінічних спостережень лікарського засобу Протефлазід^®, краплі, вважають за доцільне застосування препарату з метою профілактики та противірусної терапії коронавірусної інфекції SARS-CoV-2 [32].

З урахуванням даних доклінічних досліджень, результатів клінічного застосування та рекомендацій, викладених в інформаційному листі про нововведення в сфері охорони здоров’я «Антивірусна активність флавоноїдного препарату Протефлазід^®», медичні заклади почали активно формувати локальні клінічні протоколи первинної медичної допомоги «Коронавірусна хвороба (СOVID-19). Амбулаторний етап». У зазначених протоколах рекомендовано застосовувати Протефлазід^®, краплі, при СOVID-19 легкого та середнього ступеня тяжкості в умовах амбулаторного лікування, оскільки противірусні препарати прямої дії мають призначатися безпосередньо на самому початку захворювання, щоб попередити небезпечне зростання вірусного навантаження в організмі хворого. Розробники локальних протоколів вважають, що такий підхід дозволить суттєво знизити навантаження на стаціонари лікувальних установ.

Необхідно чітко розуміти, в першу чергу сімейним лікарям, що COVID-19 — системне захворювання, зумовлене наростанням в організмі хворої людини вірусного навантаження внаслідок неконтрольованого розмноження коронавірусу SARS-CoV-2 та серйозними ускладненнями перебігу хвороби, залежно від стадії захворювання.

Висновок

COVID-19 належить до групи гострих респіраторних вірусних інфекцій (ГРВІ), які повинні лікувати в амбулаторних умовах, починаючи з появи перших ознак захворювання у пацієнта, і чим раніше розпочнеться лікування, тим більш ефективним буде його результат. Призначення на початку захворювання етіотропного противірусного засобу надасть можливість убезпечити хворого від наростання вірусного навантаження та можливих ускладнень внаслідок патогенетичних проявів коронавірусної хвороби COVID-19.

Препарат Протефлазід^® показаний для лікування ГРВІ, є етіотропним препаратом, який інгібує вірусні РНК-полімеразу та 3СL-протеазу, про що зазначено в діючій інструкції, тобто юридично і клінічно має всі підстави для застосування при лікуванні ГРВІ, зумовленої вірусом SARS-CoV-2.

Список використаної літератури

• 1. Гриневич О.Й., Маркович І.Г. (2013) Коронавірус: проблеми та перспективи. Укр. мед. часопис, 3: 45–48.
• 2. Grynevych O., Borshov S., Matyash V. et al. (2021) Proteflazid^® effectiveness for prevention and treatment of acute viral respiratory infections in the conditions of COVID-19 in the conditions of SARS-COV-2. Pol. Med. J., XLIX (292): 255–265.
• 3. Matyash V., Grynevych O., Broun T. (2019) PROTEFLAZID®: clinical studies as evidence base of its antiviral activity. Pol. Med. J., XLVI (271): 30–31.
• 4. Інструкція для медичного застосування лікарського засобу Протефлазід® (зі змінами, згідно з наказом МОЗ України від 06.08.2021 р. № 1680).
• 5. Пальчиковська Л.Г., Васильченко О.В., Платонов М.О. и др. (2013) Антивирусные свойства растительных флавоноидов — ингибиторов синтеза ДНК и РНК. Biopolymers and Cell, 29(2): 150–156.
• 6. Рибалко С.Л. (2020) Вивчення антивірусної активності препарату Протефлазід®, його активних структур на моделі коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней. ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України», 42 с.
• 7. Рыбалко С.Л. (2010) Отчет о изучении механизмов действия биологически-активных веществ лечебной субстанции Протефлазида. ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України», Киев, 83 с.
• 8. Abian O., Ortega-Alarcon D., Jimenez-Alesanco A. et al. (2020) Structural stability of SARS-CoV-2 3CLpro and identification of quercetin as an inhibitor by experimental screening. Int. J. Biol. Macromol., 164: 1693–1703.
• 9. Дерябин О.Н., Завелевич М.П., Старосила Д.Б. и др. (2020) Природные полифенолы как ингибиторы взаимодействия коронавирусов с клетками: обзор литературы и экспериментальные данные. Укр. мед. часопис, 3(137), Т. 1: 1–5.
• 10. Chen S., Short J.A., Young D.F. et al. (2010) Heterocellular induction of interferon by negative-sense RNA viruses. Virology, 407: 247–255.
• 11. Jo S., Kim S., Shin D.H., Kim M.S. (2020) Inhibition of SARS-CoV 3CL protease by flavonoids. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 35(1): 145–151.
• 12. Lee C. (2018) Therapeutic Modulation of Virus-Induced Oxidative Stress via the Nrf2-Dependent Antioxidative Pathway. Oxidative Med. Cell. Longev., 6208067.
• 13. Li F. (2012) Evidence for a common evolutionary origin of coronavirus spike protein receptor-binding subunits. J. Virol., 86: 2856–2858.
• 14. Li W., Moore M.J., Vasilieva N. et al. (2003) Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature, 426: 450–454.
• 15. McCord J.M., Hybertson B.M., Cota-Gomez A., Gao B. (2020) Nrf2 Activator PB125® as a Potential Therapeutic Agent Against COVID-19. bioRxiv 2020.
• 16. Nguyen T.T., Woo H.J., Kang H.K. et al. (2012) Flavonoid-mediated inhibition of SARS coronavirus 3C-like protease expressed in Pichia pastoris. Biotechnol. Lett., 34: 831–838.
• 17. Mendonca P., Soliman K.F.A. (2020) Flavonoids Activation of the Transcription Factor Nrf2 as a Hypothesis Approach for the Prevention and Modulation of SARS-CoV-2 Infection Severity. Antioxidants (Basel), 9: 659. doi:10.3390/antiox9080659.
• 18. Ryu Y.B., Jeong H.J., Kim J.H. et al. (2010) Biflavonoids from Torreya nucifera displaying SARS-CoV 3CL(pro) inhibition. Bioorg. Med. Chem., 18: 7940–7947.
• 19. Seelinger G., Merfort I., Schempp C.M. (2008) Anti-oxidant, antiinflammatory and anti-allergic activities of luteolin. Planta Med., 74(14): 1667–1677.
• 20. Silva-Palacios A., Ostolga-Chavarria M., Zazueta C., Konigsberg M. (2018) Nrf2: Molecular and epigenetic regulation during aging. Ageing Res. Rev., 47: 31–40.
• 21. Theoharides T.C. (2020) COVID-19, pulmonary mast cells, cytokine storms and beneficial actions of luteolin. BioFactors: 1–3.
• 22. Wang M.M., Lu M., Zhang C.L. et al. (2018) Oxidative stress modulates the expression of toll-like receptor 3 during respiratory syncytial virus infection in human lung epithelial A549 cells. Mol. Med. Rep., 18: 1867–1877.
• 23. Weng Z., Patel A.B., Panagiotidou S., Theoharides T.C. (2015) The novel flavone tetramethoxyluteolin is a potent inhibitor of human mast cells. J. Allergy Clin. Immunol., 135(4):1044–1052.e5.
• 24. Wrapp D., Wang N., Corbett K.S. et al. (2020) structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 367: 1260–1263.
• 25. Xue G., Gong L., Yuan C. et al. (2017) A structural mechanism of flavonoids in inhibiting serine proteases. Food Funct., 8(7): 2437–2443.
• 26. Zakaryan H., Arabyan E., Oo A., Zandi K. (2017) Flavonoids: Promising natural compounds against viral infections. Arch. Virol., 162: 2539–2551.
• 27. Luzhetskyy A. (2021) Report: Inhibition of 3CL protease (SARS-CoV-2) by proteflasid. Helmholtz Centre for Infection Research. University of Saarland, Germany. Saarbrucken, 2 р.
• 28. Tseng Ch.-T.K., Drelich A.K. (2021) Report «The efficacy assessment of new compound against SARS-CoV-2 infection in in vitro models. Galveston National Laboratory, Galveston, USA, 4 р.
• 29. ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України», Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, УКРМЕДПАТЕНТІНФОРМ (2021) Інформаційний лист про нововведення в сфері охорони здоров’я «Антивірусна активність флаваноїдного препарату Протефлазід®», 4 c.
• 30. Інструкція для медичного застосування лікарського засобу Флавовір® (зі змінами, згідно з наказом МОЗ України від 10.09.2021 р. № 1922).
• 31. Момотюк Л.Є., Ященко Л.О., Мотузка О.М. (2020) Заключний звіт «Формування бази даних та статистичний аналіз ефективності використання препарату Протефлазід, краплі в умовах COVID-19». Національна академія статистики, обліку та аудиту. Київ, 38 с.
• 32. Рекомендаційний лист НАМН України від 16.03.2021 р. № 5-03/487 щодо доцільності використання препарату Протефлазід®, краплі, при COVID-19.
• 33. Karamuska T. (2020) Interim report «Evaluation of the antiviral activity of a test item against SARS-CoV-2 in vitro in Vero E6 cells» IRTA-CreSA Universitat Autonoma de Barcelona, Barcelona, Spain, 8 р.