Особливості функціонування місцевого імунітету у дітей з недиференційованою дисплазією сполучної тканини

Вступ

Важливою функцією сполучної тканини в організмі є підтримання імунного гомеостазу. Саме тому науковці приділяють велику увагу вивченню стану імунної відповіді у дітей з недиференційованою дисплазією сполучної тканини (НДСТ) (Ошлянська О.А., 2007; Кухарська Н.Г., 2011; Процюк Т.Л. и соавт., 2011; Конюшевская А.А., Франчук М.А., 2012; Ошлянська О.А. та співавт., 2017).

Оскільки у дітей з НДСТ перше місце серед усієї патології займають рецидивні респіраторні інфекції, заслуговує на увагу питання вивчення особливостей функціонування імунітету в розвитку гострих респіраторних захворювань у цих дітей.

Особливу увагу привертає стан первинної ланки імунної системи, що відіграє провідну роль при контакті з інфекційними чинниками. Місцевий імунітет є сукупністю реагування всіх імунокомпетентних клітин, що заселяють слизові оболонки: клітин лімфоїдного ряду, макрофагів, нейтрофільних і еозинофільних гранулоцитів, лаброцитів з іншими клітинами сполучної тканини та епітелію (Чернишова Л.І. та співавт., 2001). Специфічні захисні механізми слизових оболонок реалізуються завдяки функціям як імунокомпетентних, так і інших клітин, месенджерами ефектів яких постають імуноглобуліни (Ig) різних класів та секреторні цитокіни, перш за все інтерлейкіни (ІЛ) (Юлиш Е.И., 2010) (рисунок). Оскільки найчастішим місцем репродукції вірусів і бактерій є клітини епітеліальної поверхні дихальної системи, роль місцевого імунітету у формуванні резистентності організму до збудників інфекцій у дитини важко переоцінити.

Рисунок. Схема кооперації основних імунокомпетентних клітин в імунному захисті слизових оболонок (червоним кольором позначена стимулююча, блакитним — пригнічуюча дія)

Протягом останніх років увагу науковців привертає вивчення молекул, які утворюються клітинами для міжклітинного зв’язку та взаєморегуляції їх діяльності, а саме цитокінів (Нестерова И.В. и соавт., 2004; Иванов В.В., Шипилов М.В., 2012; Кириллова Т.В., 2013). Це різноманітні біологічно активні молекули білкової структури, що секретуються клітинами імунної системи при запаленні, гемопоезі тощо (Симбирцев А.С., 2002; Притулина Ю.Г. и соавт., 2004; Bermejo-Martin J.F. et al., 2007). Вони проявляють свою активність як дистанційно, так і при міжклітинному контакті. Синтезуючись у вогнищі запалення, цитокіни впливають на всіх учасників цього процесу (макрофаги, гранулоцити, фібробласти, Т- і В-лімфоцити), причому в різних випадках одна й та сама молекула може чинити як пригнічуючу, так і стимулюючу дію. Цитокінова система є саморегулюючою, цей процес відбувається за рахунок постійної кооперації між її компонентами. Домінування клітинної чи гуморальної імунної відповіді залежить від синергізму або антагонізму взаємодії цитокінів у різних випадках. Так, ІЛ-4 у комплексі з інтерфероном (IFN)-γ, ІЛ-10 та ІЛ-2 постає ключовим фактором в ініціації імунної відповіді. Причому розвитку клітинної імунної відповіді сприяє переважання ІЛ-2 та IFN-γ в оточенні Т-лімфоцитів у момент контакту з антигеном, які тоді диференціюються у Т-хелпери 1-го типу (Тh1). Переважання ІЛ-4 та -10 призводить до стимуляції синтезу Т-хелперів 2-го типу (Th2) з подальшою секрецією ІЛ-5, -6, -9 та -13, що, у свою чергу, стимулює гуморальну ланку системи імунітету (див. рисунок). Динамічна рівновага функцій між Th1- та Th2-лімфоцитами зумовлюється взаємосупресорним впливом медіаторів, які синтезуються цими субпопуляціями. Відомо, що між двома субпопуляціями Т-хелперів відношення антагоністичні: так IFN-γ, який продукують Th1-лімфоцити, уповільнює проліферацію Th2; а ІЛ-10 з Th2 знижує секрецію цитокінів з Th1-клітин, цитотокстичних Т-клітин та природних кілерів (NK-клітин) (Демьянов А.В. и соавт., 2003; Сепиашвили Р.И., 2003; Oppenheim J., Feidman M., 2015).

Функціонально всі частини імунної системи слизової оболонки тісно пов’язані. Ще в кінці 1970-х років висунуто концепцію спільного імунітету слизових оболонок, феномен «солідарності слизових оболонок», суть якого полягає в тому, що, в якому б місці слизової оболонки не відбувся контакт організму з антигеном, інформація про нього пошириться на всі ланки загальної імунної системи слизових оболонок.

Слина — найдоступніший секрет організму для вивчення. Відсутність інвазивного забору цього матеріалу для дослідження робить перспективними скринінгові дослідження в цьому напрямку. Саме тому при дослідженні особливостей місцевого імунітету у дітей з рекурентними респіраторними захворюваннями, зокрема у дітей з ознаками НДСТ, ми вважали доцільним використання слини.

Мета — проаналізувати взаємозв’язок між показниками клітинного та гуморального місцевого імунітету, окремими показниками цитокінового профілю та місцевого клітинного імунітету у дітей з/без ознак НДСТ.

Об’єкт і методи дослідження

У 40 дітей віком 2–6 років, яких спостерігали в ТОВ «ДМЦ «Добробут» (20 дітей з НДСТ та 20 — без клінічних ознак НДСТ), проведене імуноферментне дослідження змішаної слини. У 20 дітей (7 з НДСТ та 13 — без клінічних ознак НДСТ) проведене імуноцитохімічне та морфологічне дослідження мазків зішкрябів з поверхні піднебінних мигдаликів.

У групу дітей з НДСТ включені діти з наявністю не менше трьох ознак дисплазії сполучної тканини в різних системах організму. Забір нестимульованої змішаної слини та зішкряби з піднебінних мигдаликів у дітей проводили в період відсутності в них респіраторних захворювань та загострень хронічної патології.

Визначення концентрації Ig А та G виконували методом двоступінчатого «сендвіч»-варіанта твердофазного імуноферментного аналізу з використанням моноклональних специфічних антитіл до Ig фірми ЗАТ «Вектор-Бест» (Російська Федерація). Визначення концентрації ІЛ-4, -10 та IFN-γ проводили методом трьохстадійного «сендвіч»-варіанта твердофазного імуноферментного аналізу з використанням відповідних моноклональних антитіл до ІЛ-4 та -10 фірми ЗАТ «Вектор-Бест» (Російська Федерація) (Сенников С.В., Силков А.Н., 2005; Плотникова М.А. и соавт., 2012). Рівень компонента комплементу С3 у змішаній слині визначали твердофазним імуноферментним аналізом за допомогою методу AssayMax Complement C3 ELISA Kit реагентами виробництва компанії «DIACLONE» (Франція) (Crowther J.R., 1995). Дослідження препаратів зішкрябів у прохідному світлі проводили на дослідницькому мікроскопі «Olуmpus ВХ-51» (Японія).

Імуноцитохімічні методи включали:

• непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення кластерів диференціювання (CD): CD68 (маркер макрофагів) та CD16 (натуральні кілери);
• непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення антигенів до Ig Е та А (Тиц Н., 2006).

Аналіз експресії антигенів при проведенні імуноцитохімічних досліджень при визначенні рецепторів до Ig проведений у клітинах багатошарового плоского епітелію, молекул CD68 та CD16 — у клітинах лімфоїдного ряду, нейтрофілах та макрофагах.

Підрахунок експресуючих клітин проводили в п’яти полях зору при збільшенні у 400 разів, для кожного випадку вираховували середнє значення. Під час морфологічного дослідження розповсюдженість та інтенсивність реакції оцінювали напівкількісним методом у балах — від 0 до 3 балів:

• розповсюдженість: 0 балів — немає забарвлення, 1 бал — <10% позитивно забарвлених клітин, 2 бали — 10–50% позитивно забарвлених клітин, 3 бали — гомогенне забарвлення >50% клітин;
• інтенсивність реакції: 0 балів — немає видимого забарвлення, 1 бал — слабке, 2 бали — помірне, 3 бали — виражене забарвлення.

Усі імуноферментні аналізи проведено в лабораторії «ДІЛА» (Київ). Імуноцитохімічні та морфологічні дослідження проводили в лабораторії патоморфології ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України» (Київ).

Статистичну обробку результатів дослідження проведено за допомогою пакета програм «Microsoft Excel».

Результати та їх обговорення

Результати проведеного аналізу вмісту окремих показників місцевого гуморального імунітету в обстежених дітей свідчать про наявність відмінностей у групах спостереження (таблиця).

За результатами імуноферментного аналізу відзначено нижчі рівні ІЛ-4 та -10, IgA, компонента комплементу С3 у змішаній слині та вищий рівень IgG у дітей з НДСТ порівняно з такими у дітей без ознак НДСТ. Вміст IFN-γ у дітей з НДСТ суттєво не відрізнявся від значення у дітей без НДСТ. При цьому в них виявлено і меншу експресію ІgА, CD68 та CD16 на імунокомпетентних клітинах зішкрябів з мигдаликів та більшу експресію антигенів до IgЕ.

Клітинний та гуморальний імунітет тісно взаємопов’язані й діють у функціональному взаємозв’язку. Їх злагоджена робота має на слизових оболонках одну цілеспрямованість — захист організму людини від проникнення вірусів і бактерій. Ця тенденція чітко простежується під час аналізу і клітинного та гуморального імунітету. Так, при проведенні цитохімічного, морфологічного та імуноферментного аналізу виявлено, що показники гуморального та клітинного місцевого імунітету нижчі у групі дітей з клінічними проявами НДСТ, що може сприяти частішій захворюваності дітей цієї групи на респіраторну патологію.

Під час проведення рангового кореляційного аналізу виявлено щільні кореляційні зв’язки між рівнем експресії антигенів до IgА та вмістом IgG у слині (r=0,50), а також його зворотний зв’язок зі співвідношенням ІЛ-10/(IgA + IgG в г/л) (r=–0,86). Можна припустити, що підвищення експресії рецепторів до Ig А на імунокомпетентних клітинах мигдаликів внаслідок надмірної стимуляції інфекційними антигенами призводить до активації системної імунної відповіді та підвищення дифузії Ig із сироватки крові до слини. Їх зростання шляхом негативного зворотного зв’язку пригнічує викид ІЛ-10, що спричиняє обмежену місцеву імунну відповідь.

Порушення цих процесів при НДСТ підтверджується різним значенням кореляційних показників у групі дітей з/без НДСТ.

Виявлений зворотний кореляційний зв’язок експресії антигенів до IgА з вмістом ІЛ-4 у слині (r=–0,84) та ІЛ-10 у слині (r=–0,83) підтверджує компенсаторну роль зазначених ІЛ в імунній відповіді: надмірна продукція ІЛ-10 та -4 за принципом негативного зворотного зв’язку здатна обмежувати активацію В-лімфоцитів, продукцію Ig та їх взаємодію з рецепторами, що необхідно для припинення запального процесу. Відзначимо, що ці кореляційні зв’язки були такі високі лише у групі дітей з НДСТ.

Також у групі дітей з НДСТ ступінь експресії рецепторів до IgА певною мірою залежить від співвідношення цитокінів ІЛ-10/ІЛ-4 (r=–0,53), ІЛ-10/IFN-γ (r=–0,83), що свідчить про провідну роль саме ІЛ-10 у зменшенні експресії рецепторів до секреторного IgА на імунокомпетентних клітинах мигдаликів.

Підвищення вмісту компонента комплементу С3 у слині також призводить до зменшення експресії IgА на імунокомпетентних клітинах мигдаликів у дітей з НДСТ (r=–0,61), що відображає іншу важливу роль механізмів неспецифічного імунного захисту — зростання опсонізації та фагоцитозу патогенів компенсує недостатню ефективність специфічної місцевої імунної відповіді.

Значення макрофагів для активації гуморальної імунної відповіді при НДСТ підтверджує і виявлені кореляційні зв’язки між рівнем експресії CD68 і вмістом ІЛ-4 (r=0,50) та співвідношеннями ІЛ-4/IgA (r=0,63), IgG/IgА (r=0,58).

Активація нейтрофілів також сприяє посиленню гуморального імунітету: коефіцієнт кореляції між рівнем експресії CD16 та вмістом IgG у слині обстежених дітей сягає 0,57, між вираженістю експресії CD16 та співвідношенням IgG/IgА становить 0,51 у групі дітей з НДСТ. Навпаки, у дітей без НДСТ відзначено пряму кореляційну залежність між рівнем експресії CD16 та співвідношенням IgG/IgА (r=0,50).

З іншого боку, прорив місцевого захисту і посилення системної гуморальної імунної відповіді пригнічує як активацію макрофагів на мигдаликах (зворотний зв’язок між IgА та експресією CD-68 (r=–0,62)) у дітей з НДСТ, так і нейтрофілів (зворотний зв’язок між співвідношенням ІЛ-10/ІЛ-4 та експресією CD16 (r=–0,50) у дітей без НДСТ).

Цікавим стало виявлення у дітей з НДСТ прямої залежності ступеня експресії антигенів до IgЕ на клітинах багатошарового плоского епітелію мигдаликів від рівня загального IgG (r=0,66) у змішаній слині, чого не спостерігали в групі дітей без клінічних проявів НДСТ. Отримані результати можуть свідчити, що зменшення протиінфекційної відповіді у дітей з НДСТ спричиняє розвиток субклінічної сенсибілізації організму природними інфекційними антигенами та алергенами і потенційно підвищує ризик розвитку алергічної патології, перебіг якої часто відбувається під маскою інфекційних процесів і хибно підвищує загальну захворюваність у дітей з НДСТ.

Проте проведений ранговий кореляційний аналіз у групі дітей без НДСТ виявив прямий кореляційний зв’язок між рівнем експресії антигенів CD16 та рівнем компонента С3 (r=0,52), вмістом загального IgА (r=0,52), коефіцієнтами співвідношення ІЛ-10/ІЛ-4 (r=0,50), ІЛ-10/IFN-γ (r=0,53). Так, навпаки, виявлено обернено пропорційний зв’язок між рівнем експресії антигенів до CD68 та ІЛ-10 (r=–0,85), рівнем загального IgА(r=–0,50), коефіцієнтами співвідношення ІЛ-10/(IgA + IgG в г/л) (r=–0,51), ІЛ-10/ IFN-γ (r=–0,88). Цих закономірностей у дітей з НДСТ не виявлено.

Отже, результати проведеного дослідження свідчать, що у дітей з НДСТ відбуваються суттєві взаємопов’язані зміни в усіх ланках місцевого імунітету, що може сприяти персистенції патогенів, колонізації ними носоглотки, послабленню презентації антигенів та формуванню системної імунної відповіді, підвищенню ризику сенсибілізації організму.

Висновки

1. У дітей з клінічними ознаками НДСТ відзначено нижчі рівні у слині ІЛ-4, ІЛ-10, IgA, компонента комплементу С3 та вищий рівень IgG, а також нижчі рівні експресії антигенів до IgA, маркерів макрофагів CD68, CD16 у зішкрябах із піднебінних мигдаликів порівняно з такими у дітей без ознак НДСТ.

2. Зазначені показники взаємопов’язані між собою і відображають компенсаторну реакцію імунної системи у дітей з НДСТ, що, з одного боку, може бути спричинено мембранним диморфізмом, з іншого — вищою захворюваністю при НДСТ.

3. Найбільш очевидними є кореляційні зв’язки між рівнем експресії антигенів до IgА та вмістом IgG у слині (r=0,50), а також його зворотний зв’язок із співвідношенням ІЛ-10/(IgA+IgG в г/л) (r=–0,86), вмістом ІЛ-4 у слині (r=–0,84) та ІЛ-10 у слині (r=–0,83) зі співвідношенням цитокінів ІЛ-10/ІЛ-4 (r=–0,53), ІЛ-10/ IFN-γ (r=–83), компонента комплементу С3 (r=–0,61), що відображає взаємозумовленість різних механізмів імунного захисту у дітей з НДСТ.

4. Незбалансоване посилення системної протиінфекційної імунної відповіді при НДСТ сприяє посиленню експресії рецепторів до IgЕ, що свідчить і про підвищений ризик розвитку алергічних захворювань у цих дітей та потребує подальшого дослідження.

Список використаної літератури

• Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. (2003) Диагностическая ценность исследований уровней цитокинов в клинической практике. Цитокины и воспаление, 2(3): 20–33.
• Иванов В.В., Шипилов М.В. (2012) Исследование концентрации цитокинов, вырабатываемых Th₂-лимфоцитами, у больных парагриппом. В кн.: Медицина: вызовы сегодняшнего дня. Материалы Междунар. науч. конф., июнь 2012 г., Челябинск, с. 39–41.
• Кириллова Т.В. (2013) Показатели цитокинового профиля у больных лимфомами. БМИК, 3: 525.
• Конюшевская А.А., Франчук М.А. (2012) Синдром недифференцированной дисплазии соединительной ткани. Пульмонологические аспекты. Здоровье ребенка, 7(42): 46–48.
• Кухарська Н.Г. (2011) Імунологічні особливості дітей з недиференційованою дисплазією сполучної тканини та шляхи до їх імунореабілітації. Автореф. дис. … канд. мед. наук, Київ, 23 с.
• Нестерова И.В., Малиновская В.В., Тараканов В.А., Ковалева С.В. (2004) Интерфероно- и иммунотерапия в практике лечения часто и длительно болеющих детей и взрослых. Москва, 160 с.
• Ошлянська О.А. (2007) До питання про роль місцевого специфічного імунітету у формуванні аутоімунної патології у дітей з вродженою недиференційованою дисплазією сполучної тканини. Перинатол. педиатр., 4: 81–84.
• Ошлянська О.А., Задорожна Т. Д., Пустовалова О.І., Вовк В.М. (2017) Деякі особливості місцевого клітинного імунітету у дітей з недиференційованою дисплазією сполучної тканини. Совр. педиатр., 5(85): 26–33.
• Плотникова М.А., Клотченко С.А., Егоров В.В. и др. (2012) Применение твердофазного иммуноферментного анализа в формате микрочипа для количественного определения уровня цитокинов. Мед. иммунол., 14(4–5): 415–418.
• Притулина Ю.Г., Криворучко И.В., Шенцова В.В. и др. (2004) Практическая значимость анализа цитокинового профиля при ряде инфекционных заболеваний. Здоровье ребенка, 1(2): 54–61.
• Процюк Т.Л., Чирка О.В., Суркова Н.М. и др. (2011) Особенности клинического течения бронхиальной астмы и атопического дерматита, ассоциированных с проявлениями недифференцированной дисплазии соединительной ткани у детей. Перинатол. педиатр., 2(46): 113–115.
• Сенников С.В., Силков А.Н. (2005) Методы определения цитокинов. Цитокины и воспаление, 4(1): 22–27.
• Сепиашвили Р.И. (2003) Функциональная система иммунного гомеостаза. Аллергол. иммунол., 4(2): 5–14.
• Симбирцев А.С. (2002) Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление, 1: 9–17.
• Тиц Н. (2006) Клиническое руководство по лабораторным тестам. Лабинформ, Москва, 960 с.
• Чернишова Л.І., Синяченко В.В., Науменко Н.В. (2001) Мукозальний імунітет та його корекція при інфекціях верхніх дихальних шляхів. Перинатол. педіатр., 3: 76–79.
• Юлиш Е.И. (2010) Факторы местного иммунитета при респираторных инфекциях и методы их активации. Здоровье ребенка, 5(26): 36–42.
• Bermejo-Martin J.F., Garcia-Arevalo M.C., De Lejarazu R.O. et al. (2007) Predominance of Th₂ cytokines, CXC chemokines and innate immunity mediators at the mucosal level during severe respiratory syncytial virus infection in children. Eur. Cytokine Netw, 18(3): 162–167.
• Crowther J.R. (1995) The ELISA Guidebook. Humana Press Inc., 218 p.
• Oppenheim J., Feidman M. (2000) Cytokine Reference. A Compendium of Cytokines and Other Mediators of Host Defense. Academic Press, London.

Адреса для листування:
Вовк Вікторія Миколаївна
02068, Київ, вул. Драгоманова, 21А
ТОВ «ДМЦ «Добробут»
E-mail: [email protected]

Одержано 10.04.2018