Клінічне значення генетичного поліморфізму цитохрому CYP 2C9 у розвитку НПЗП-гастропатій, ускладнених шлунково-кишковою кровотечею

Вступ

Шлунково-кишкові кровотечі (ШКК), асоційовані із застосуванням нестероїдних протизапальних препаратів (НПЗП), розглядають як один із найчастіших побічних ефектів цієї групи препаратів, що зумовлює високий рівень госпіталізації та смертності пацієнтів, особливо похилого віку (Pilotto A. et al., 2003; Pilotto A. et al., 2005). На сьогодні встановлено декілька факторів, що впливають на ризик розвитку НПЗП-індукованих ШКК: похилий вік, наявність виразки шлунка чи дванадцятипалої кишки в анамнезі, застосування НПЗП у високих дозах, одночасний прийом декількох НПЗП, застосування їх зі стероїдами, варфарином.

Багато неселективних НПЗП (диклофенак, ібупрофен, напроксен, піроксикам) і селективних інгібіторів циклооксигенази-2 метаболізуються у системі цитохром Р450, зокрема за допомогою ізоферменту CYP 2C9 (Güzey C., Spigset O., 2004). Ген, що кодує CYP 2C9, у своєму кодуючому ланцюгу часто має нуклеотидний поліморфізм. Порівняно зі звичайним найпоширенішим «диким типом» CYP 2C9*1 є ще два досить розповсюджених варіанти поліморфізму із заміною амінокислот у молекулі ферменту CYP 2C9: CYP 2C9*2 (Арг144 → Цис) і CYP 2C9*3 (Іл359 → Лей) (Sim S.C., Ingelman-Sundberg M., 2006). У дослідженнях щодо метаболізму НПЗП іn vitro та in vivo доведено, що варіант CYP 2C9*3 знижує активність ферменту значно сильніше, ніж CYP 2C9*2 (Lee C.R. et al., 2002). Встановлено, що у 6–10% представників європеоїдної раси наявний саме варіант CYP 2C9*3 (Scordo M.G. et al., 2001). У носіїв алеля CYP 2C9*3, яких лікували варфарином та фенітоїном, виявлено підвищену частоту розвитку небажаних серйозних побічних реакцій (Higashi M.K. et al., 2002; Soga Y. et al., 2004; Kirchheiner J., Brockmöller J., 2005). Проте клінічні наслідки впливу поліморфізму CYP 2C9 на розвиток НПЗП-гастропатій, зокрема ускладнених ШКК, досі вивчені недостатньо.

Мета дослідження — оцінка впливу поліморфізму CYP 2C9 на ризик розвитку НПЗП-гастропатій, ускладнених ШКК.

Об’єкт і методи дослідження

Нами проведено дослідження за типом «випадок — контроль», в якому взяли участь пацієнти, що короткочасно (протягом 7 днів–1 міс) застосовували різні НПЗП з приводу деформівного остеоартрозу. Дослідження проведено відповідно до Гельсінксь­кої декларації та рекомендацій Good Сlinical Practice, а також узгоджено з місцевим комітетом з етики. Усі пацієнти надали письмову згоду щодо участі.

У дослідження включено 27 пацієнтів (13 чоловіків, 14 жінок; середній вік становив 68,2±6,6 року) із кровотечами з верхніх відділів ШКТ, які підтверджено ендоскопічно і діагностовано як НПЗП-індуковані. Діагноз НПЗП-асоційованої ШКТ встановлювали на основі таких критеріїв, як: наявність відповідної симптоматики (гематемезис, мелена, анемія із втратою понад 3 г гемоглобіну) та ендоскопічної картини ШКК, встановленої відповідно до L. Laine, W.L. Peterson (1994):

• наявність розлитої пігментованої плями (червоної, пурпурової, коричневої чи чорної), в’язкого згустку на поверхні, візуалізованих судин або кровотечі;
• короткочасне (<1 міс) застосування НПЗП, що метаболізуються за допомогою CYP 2C9 (целекоксиб, диклофенак, ібупрофен, напроксен).

Усі пацієнти застосовували НПЗП з приводу остеоартрозу. Джерелом ШКК були: виразка шлунка (n=7) або дванадцятипалої кишки (n=8), ерозивний гастрит (n=12).

Критеріями виключення були:

• кровотеча з вен стравоходу;
• захворювання згортальної системи крові;
• шлункова-кишкова неоплазія верхніх відділів ШКТ;
• Helicobacter pylori-інфекція, виявлена за допомогою швидкого уреазного або 13С-сечовинного дихального тесту або їх комбінації;
• постійне чи короткотривале застосування ацетилсаліцилової кислоти, прийом інгібіторів протонної помпи або інших гастропротекторів, застосування інших лікарських засобів, що метаболізуються за допомогою ізоферменту CYP 2C9, таких як антигіперглікемічні (толбутамід, гліпізид), антигіпертензивні (ірбесартан, лозартан) препарати, фенітоїн, силденафін, тербінафін, варфарин.

Контрольну групу становили 32 особи (18 чоловіків, 14 жінок; середній вік — 70,4±10,8 року) з ендоскопічно підтвердженою відсутністю ШКК, які застосовували НПЗП протягом <1 міс. Демографічні та клінічні показники пацієнтів, зібрані шляхом збору анамнезу та клінічної оцінки їхнього стану, представлені у табл. 1.
Таблиця 1. Клінічна характеристика обстежених пацієнтів та групи контролю

У всіх обстежуваних відповідно до стандартного метода з периферичної крові (лейкоцитів) отримували зразки ДНК, досліджені в сертифікованій генетичній лабораторії. CYP 2C9-алелі визначені відповідно до Human cytochrome P450 allele nomenclature committee (Sim S.C., Ingelman-Sundberg M., 2006). Два одиночні нуклеотидні поліморфізми — rs1799853 (C430 → T), що ідентифікує CYP 2C9*2-алель, та rs1057910 (A1075 → C), що відноситься до CYP 2C9*3-алеля — визначені з укороченого фрагменту. Генотипування алеля CYP 2C9*2 проведено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з ендонуклеазою AvaII. Ідентифікацію алеля CYP 2C9*3 проведено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з праймером 5’-CAGCTAAAGTCCAGGAAGAGAT-3’ та мутантним праймером 5’-AGGCTGGTGGGGAGAAGCTC-3’ (Stubbins M.J. et al., 1996). Кожен зразок вміщував 0,5 мг геномної ДНК та 15 пкмоль кожного праймеру, 100 ммоль/л dNTP, 10 ммоль/л Tris НСl pH 8,3, 50 ммоль/л КСl, 1,5 ммоль/л MgCl2 і 1 U-термостійку Taq полімеразу. 30 циклів складалися з таких кроків: 1 хв при температурі 95 °С, 50 с — при 60° С, 1,5 хв — при 72° С. Потім 15 мл ампліфікованих продуктів переведені на 5 год при температурі 37 °С із 2 U-вкороченим ензимом. Фракціонування фрагментів здійснювали 3% агаровим гелем за допомогою електрофорезу і візуалізували під ультрафіолетовим світлом.

Враховуючи статистичну похибку у 5%, встановлений мінімум в обох групах (контроль та випадок), необхідний для визначення зв’язку між CYP 2C9 і кровотечею, дорівнював 26. Гіпотези відносно різниці у групах перевірені з використанням тесту Фішера та U-тесту Манна — Уїтні. Пов’язані частоти алелей визначені методом підрахунку генів, при цьому застосовували критерій χ² Пірсона. Усі дослідження проведені за допомогою пакета «R-statіstics».

Результати та їх обговорення

Застосовуючи генотип CYP 2C9*1/*1 («дикий тип») як референтний, встановлено, що у пацієнтів із ШКК порівняно з пацієнтами контрольної групи значно частіше виявляли генотипи CYP 2C9*1/*3 (33,3 та 6,8% відповідно; р<0,005) та CYP 2C9*1/*2 (25,9 та 15,6% відповідно; р<0,05). Вірогідної різниці у контрольній групі та групі пацієнтів із кровотечами щодо гетерозигот CYP 2C9*2/*3 (3,7 та 3,1% відповідно) не виявлено. Генотипи CYP 2C9*1/*3 та CYP 2C9*1/*2 явно асоціювалися з підвищеним ризиком розвитку НПЗП-індукованих ШКК, в той час як CYP 2C9*2/*3 не був вірогідно пов’язаний із розвитком цієї патології (табл. 2). Також за генами CYP 2C9*2/*2 та CYP 2C9*3/*3 гомозигот у жодній із груп обстежених не виявлено. Різниці в результатах у разі поєднаної патології також не виявлено.
Таблиця 2. Генотипи CYP 2C9 у пацієнтів із НПЗП-індукованими ШКК та в групі контролю

Виходячи з результатів дослідження, слід вважати, що генотипи CYP 2C9*1/*3 та CYP 2C9*1/*2 пов’язані зі значно підвищеним ризиком розвитку НПЗП-індукованих ШКК, в той час як носії алеля CYP 2C9*2/*3 такого зв’язку не мають.

Висновки

Отримані нами результати свідчать про те, що у певної кількості пацієнтів, які короткочасно застосовували НПЗП, що метаболізуються за допомогою цитохрому CYP 2C9 (целекоксиб, диклофенак, ібупрофен, напроксен) є генетична схильність до розвитку НПЗП-індукованих ШКК. У проведеному нами дослідженні обстежено пацієнтів з ендоскопічно підтвердженими ШКК без таких супутніх факторів впливу на їх виникнення, як Helicobacter pylori-інфекція, супутня терапія іншими препаратами, що метаболізуються за допомогою цитохрому CYP 2C9, або антисекреторна гастропротекторна терапія. Оскільки довготривала терапія НПЗП викликає адаптацію слизової оболонки шлунково-кишкового тракту, що також впливає на виникнення кровотеч, до дослідження відбирали пацієнтів лише з короткочасним застосуванням НПЗП (7 днів–1 міс). Контрольну групу становили особи, за віком і статтю зіставні із основною групою, проте з ендоскопічно підтвердженою відсутністю кровотеч. У проведеному нами дослідженні частота двох основних генотипів CYP 2C9*1/*1 та CYP 2C9*1/*2 у групі контролю була зіставна з розподілом генотипів CYP 2C9, отриманих у найбільшому генотипічному дослідженні, що включило 1400 осіб європеоїдної раси: 75 та 65,3% відповідно для CYP 2C9*1/*1 та 15,6 до 20,4% — для CYP 2C9*1/*2 відповідно (Scordo M.G. et al., 2001). Гомозигот CYP 2C9*2/*2 та CYP 2C9*3/*3 в обстежених нами пацієнтів не виявлено взагалі, що порівнянно з їх низькою частотою (0,9 та 0,4% відповідно), отриманою в раніше проведених дослідженнях (Scordo M.G. et al., 2001; Rodrigues A.D., Rushmore T.H., 2002; Martínez C. et al., 2004; Rodrigues A.D., 2005; Pilotto A. et al., 2007).

Таким чином, результати проведеного нами дослідження показали, що, порівняно зі звичайним генотипом, що найчастіше виявляють (CYP 2C9*1/*1) у пацієнтів із генотипами CYP 2C9*1/*2 та CYP 2C9*1/*3, ризик розвитку кровотеч, індукованих НПЗП, значно підвищений. Ці висновки підтверджуються і дослідженням in vitro, де заміна амінокислот у ланцюгах Іл359 → Лей (CYP 2C9*3) супроводжувалася більш значним зниженням метаболічної активності, ніж заміна Арг144 → Цис (CYP 2C9*2), коли в ролі субстратів реакції застосовували диклофенак, піроксикам, теноксикам або мефенамінову кислоту (Takanashi K. et al., 2000). Також проведене нами дослідження підтверджує отримані в експерименті in vivo дані, що свідчать про погіршення у фармакокінетиці целекоксибу, диклофенаку, ібупрофену, лорноксикаму та піроксикаму у осіб — носіїв алеля CYP 2C9*3 порівняно із носіями алеля CYP 2C9*2 (Yamazaki H. et al., 1998; Dorado P. et al., 2003; Kirchheiner J. et al., 2003; García-Martín E. et al., 2004; Perini J.A. et al., 2005; Zhang Y. et al., 2005). Зазначимо, що в описаному дослідженні алель CYP 2C9*3 підвищував ризик розвитку кровотеч лише за наявності звичайного нейтрального CYP 2C9*1, але не функціо­нуючого алеля CYP 2C9*2. Це можна пояснити комбінованим ефектом різних варіантів генів CYP 2C9 та CYP 2C8. Оскільки CYP 2C9*2 тісно пов’язаний за алелем *3 у високоактивному гені CYP 2C8, підвищення активності у ферментній системі можна пояснити саме цим зв’язком (Yasar U. et al., 2002).

Проведене нами дослідження обмежене участю лише 27 пацієнтів із кровотечею та 32 контрольних пацієнтів. Достовірність дослідження становила 87,4%, тому зв’язок між CYP 2C9*1/*3 та CYP 2C9*1/*2 та виникненням НПЗП-індукованих кровотеч абсолютно вірогідний і не викликає сумніву.

Підводячи підсумок, підкреслимо, що НПЗП, що метаболізуються за участю CYP 2C9, у осіб — носіїв мутацій генів CYP 2C9*1/*3 або CYP 2C9*1/*2 — слід застосовувати з обережністю. Вважаємо доцільним проведення генотипування осіб перед застосуванням НПЗП для виявлення цих мутацій та визначення категорії високого ризику розвитку кровотеч. Проте для введення такого аналізу у клінічну практику необхідні подальші дослідження з оцінкою його ефективності на більшій кількості пацієнтів.

Дані щодо конфлікту інтересів

Конфлікту інтересів немає.

Список використаної літератури

• Dorado P., Berecz R., Norberto M.J. et al. (2003) CYP 2C9 genotypes and diclofenac metabolism in Spanish healthy volunteers. Eur. J. Clin. Pharmacol., 59(3): 221–225.
• García-Martín E., Martínez C., Tabarés B. et al. (2004) Interindividual variability in ibuprofen pharmacokinetics is related to interaction of cytochrome P450 2C8 and 2C9 amino acid polymorphisms. Clin. Pharmacol. Ther., 76(2): 119–127.
• Güzey C., Spigset O. (2004) Genotyping as a tool to predict adverse drug reactions. Curr. Top. Med. Chem., 4(13): 1411–1421.
• Higashi M.K., Veenstra D.L., Kondo L.M. et al. (2002) Association between CYP 2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy. JAMA, 287(13): 1690–1698.
• Kirchheiner J., Brockmöller J. (2005) Clinical consequences of cytochrome P450 2C9 polymorphisms. Clin. Pharmacol. Ther., 77(1): 1–16.
• Kirchheiner J., Störmer E., Meisel C. et al. (2003) Influence of CYP 2C9 genetic polymorphisms on pharmacokinetics of celecoxib and its metabolites. Pharmacogenetics, 13(8): 473–480.
• Laine L., Peterson W.L. (1994) Bleeding peptic ulcer. N. Engl. J. Med., 331(11): 717–727.
• Lee C.R., Goldstein J.A., Pieper J.A. (2002) Cytochrome P450 2C9 polymorphisms: a comprehensive review of the in-vitro and human data. Pharmacogenetics, 12(3): 251–263.
• Martínez C., Blanco G., Ladero J.M. et al. (2004) Genetic predisposition to acute gastrointestinal bleeding after NSAIDs use. Br. J. Pharmacol., 141(2): 205–208.
• Perini J.A., Vianna-Jorge R., Brogliato A.R., Suarez-Kurtz G. (2005) Influence of CYP 2C9 genotypes on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of piroxicam. Clin. Pharmacol. Ther., 78(4): 362–369.
• Pilotto A., Franceschi M., Leandro G. et al. (2003) The risk of upper gastrointestinal bleeding in elderly users of aspirin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs: the role of gastroprotective drugs. Aging Clin. Exp. Res., 15(6): 494–499.
• Pilotto A., Franceschi M., Vitale D.F. et al.; F.I.R.I. (Fondazione Italiana Ricerca Sull’Invecchiamento); Sofia Project Investigators (2005) Upper gastrointestinal symptoms and therapies in elderly out-patients, users of non-selective NSAIDs or coxibs. Aliment. Pharmacol. Ther., 22(2): 147–155.
• Pilotto A., Seripa D., Franceschi M. et al. (2007) Genetic susceptibility to nonsteroidal anti-inflammatory drug-related gastroduodenal bleeding: role of cytochrome P450 2C9 polymorphisms. Gastroenterology, 133(2): 465–471.
• Rodrigues A.D. (2005) Impact of CYP 2C9 genotype on pharmacokinetics: are all cyclooxygenase inhibitors the same? Drug Metab. Dispos., 33(11): 1567–1575.
• Rodrigues A.D., Rushmore T.H. (2002) Cytochrome P450 pharmacogenetics in drug development: in vitro studies and clinical consequences. Curr. Drug Metab., 3(3): 289–309.
• Scordo M.G., Aklillu E., Yasar U. et al. (2001) Genetic polymorphism of cytochrome P450 2C9 in a Caucasian and a black African population. Br. J. Clin. Pharmacol., 52(4): 447–450.
• Sim S.C., Ingelman-Sundberg M. (2006) The human cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee Web site: submission criteria, procedures, and objectives. Methods Mol. Biol., 320: 183–191.
• Soga Y., Nishimura F., Ohtsuka Y. et al. (2004) CYP 2C polymorphisms, phenytoin metabolism and gingival overgrowth in epileptic subjects. Life Sci., 74(7): 827–834.
• Stubbins M.J., Harries L.W., Smith G. et al. (1996) Genetic analysis of the human cytochrome P450 CYP 2C9 locus. Pharmacogenetics, 6(5): 429–439.
• Takanashi K., Tainaka H., Kobayashi K. et al. (2000) CYP 2C9 Ile359 and Leu359 variants: enzyme kinetic study with seven substrates. Pharmacogenetics, 10(2): 95–104.
• Yamazaki H., Inoue K., Chiba K. et al. (1998) Comparative studies on the catalytic roles of cytochrome P450 2C9 and its Cys- and Leu-variants in the oxidation of warfarin, flurbiprofen, and diclofenac by human liver microsomes. Biochem. Pharmacol., 56(2): 243–251.
• Yasar U., Lundgren S., Eliasson E. et al. (2002) Linkage between the CYP 2C8 and CYP 2C9 genetic polymorphisms. Biochem. Biophys. Res. Commun., 299(1): 25–28.
• Zhang Y., Zhong D., Si D. et al. (2005) Lornoxicam pharmacokinetics in relation to cytochrome P450 2C9 genotype. Br. J. Clin. Pharmacol., 59(1): 14–17.

Адреса для листування:
Онищук Людмила Олександрівна
01030, м. Київ, бульв. Тараса Шевченка, 17
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця,
кафедра внутрішньої медицини № 1
E-mail: [email protected]

Одержано 21.02.2017