«Диво-отрута» для нових ліків

Актуальність

Протеази, які в певній послідовності розщеплюють білкові мішені, контролюють численні біологічні функції. Тому можливість репрограмування їх функціональної здатності для руйнування вибірково необхідних амінокислотних послідовностей відкриває нові шляхи терапевтичного та біотехнологічного застосування цих ферментів. У новому дослідженні, представленому науковцями під керівництвом співробітників Інституту трансформаційних технологій в охороні здоров’я Р. Меркіна (Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare), США, та Гарвардського університету (Harvard University), США, повідомляється про метод лабораторної еволюції протеаз, який має потенціал терапевтичного застосування [1].

Зазначений метод дозволяє пришвидшувати зміни протеаз, які «розрізають» нові білкові послідовності та втрачають свою здатність розщеплювати нецільові фрагменти. Використовуючи цю технологію, розроблено протеази нейротоксину ботуліну — важливий клас ферментів, які можуть застосовуватись у пацієнтів для вибіркового руйнування нових мішеней, включаючи білки, первинно не пов’язані з цими протеазами. Отже, метод презентує потенційно новий терапевтичний підхід — застосування протеаз з індивідуальною специфічністю. Матеріали роботи опубліковано у журналі «Science» 19 лютого 2021 р.

Дизайн дослідження та практичне втілення результатів

Загальновідомо, що ботулотоксин — «диво-отрута» — раніше був схвалений Управлінням з контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами США (Food and Drug Administration) для терапії у пацієнтів із різними станами, зокрема хронічною мігренню, м’язовими спазмами тощо [2, 3]. У новому дослідженні вперше доведено можливість швидкого лабораторного синтезу токсину для впливу на різні білки. Це досягається створенням набору високоселективних протеаз, які можуть сприяти нейрорегенерації, регулювати активність ростових факторів, пригнічувати неконтрольоване запалення чи послаблювати гіперреактивність імунної відповіді, так званий цитокіновий шторм.

Дослідну роботу було зосереджено на вирішенні двох основних завдань. Насамперед, успішно здійснено перепрограмування протеаз. Це дозволило ферментувати абсолютно нові білкові мішені, які іноді навіть не схожі на нативні мішені вихідних протеаз. Крім того, розпочато вирішення питання «класичного виклику біології»: розроблення внутрішньоклітинної технології лікування. На відміну від більшості високомолекулярних білків, протеази ботулотоксину у великій кількості можуть проникати в нейрони, що позиціонує їх як потенційні лікувальні засоби. На цьому етапі роботи основним досягненням стало програмування індивідуальних протеаз з індивідуальними інструкціями щодо виокремлення білків.

Зазначена можливість дозволяє редагувати геном, одночасно доповнюючи нині наявні технології в цій сфері. Сучасні технології редагування геному спрямовані, перш за все, на корекцію етіологічного фактора при хронічних захворюваннях (наприклад серповидноклітинна анемія, зумовлена первинним генетичним дефектом). Однак деякі гострі захворювання, зокрема неврологічні порушення після перенесеного інсульту, не є наслідком генетичних помилок. І в подібних випадках терапія протеазами на клітинному рівні може допомогти підвищити здатність організму долати функціональні зміни, спричинені ураженням нервових структур.

Десятиліттями вчені прагнули використовувати протези в лікуванні захворювань. На відміну від антитіл, які здатні атакувати лише визначені чужорідні сполуки в організмі, протеази можуть знаходити та прикріплюватися до будь-яких протеїнів, а після зв’язування — реалізувати більше корисних можливостей, ніж просто знищувати свою мішень. Наприклад, протеази здатні реактивувати «сплячі» білки. Однак всупереч цим важливим функціональним рисам ці ферменти донині не знайшли широкого застосування як терапевтичні засоби в лікуванні людини, і, перш за все, завдяки відсутності методів розроблення створення протеаз, які розщеплюють специфічні вибрані мішені.

Однак нова технологія на основі триваючої еволюції, опосередкованої фагами (phage-assisted continuous evolution — PACE) успішно долає зазначені перешкоди. Ця клітинна платформа забезпечує безперервний розвиток нових білків із цінними функціональними властивостями. За словами авторів, технологія PACE здатна створювати десятки поколінь протеїнів на добу за мінімального втручання людини. Так, використовуючи PACE, вченими спочатку було перепрограмовано хаотичні протеази на шлях більшої вибірковості, після чого спрямовано їх активність на розпізнавання абсолютно нових мішеней, які є поза межами їх первинної компетенції. За допомогою платформи PACE здійснено еволюцію чотирьох протез із трьох сімейств ботулотоксину. У кожної з чотирьох протеаз не виявлено активності відносно їх первинних мішеней, при цьому вони набули здатності обмежувати свої нові мішені з високим рівнем специфічності — в діапазоні від 218 до більше ніж 11 000 000 разів. Водночас протеази зберігали свою здатність проникати у клітини.

Практичні висновки

За сподіванням авторів, створена технологія може стати потужним інструментом лікування на клітинному рівні. Дійсно, PACE забезпечує міцну основу для швидкої еволюції протеаз з новими можливостями, але реалізація клінічного застосування такого інструменту клітинної терапії потребує майбутньої кропіткої праці. Водночас автори окреслили наявні обмеження: білки не є ідеальними кандидатами в лікуванні хронічних захворювань, адже з часом імунна система організму ідентифікує їх як чужорідні об’єкти, атакує та знешкоджує. Незважаючи на те що тривалість персистенції ботулотоксину в клітинах є порівняно довшою (до 3 міс на відміну від типового життєвого циклу білків, що становить години чи дні), еволюційно змінені білки можуть відрізнятися коротшою тривалістю життя, що закономірно знижує їх ефективність. Тим не менш, для ідентифікації чужорідних сполук імунна система організму потребує часу. Тому протеази можуть стати ефективним інструментом тимчасового лікування. З цією метою дослідники планують продовжити пошук шляхів уникнення імунної відповіді, вивчаючи інші класи протеаз ссавців, адже організм  з нижчою імовірністю атакує білки, схожі на їх власні.

Список використаної літератури:

1. Blum T.R., Liu H., Packer M.S. et al. (2020) Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity. Science, 371(6531): 803–810. Doi: 10.1126/science.abf5972.
2. Kostrzewa R.M., Kostrzewa R.A., Kostrzewa J.P. (2015) Botulinum neurotoxin: Progress in negating its neurotoxicity; and in extending its therapeutic utility via molecular engineering. MiniReview. Peptides, 72: 80–87. doi: 10.1016/j.peptides.2015.07.003.
3. Masuyer G., Zhang S., Barkho S. et al. (2018) Structural characterisation of the catalytic domain of botulinum neurotoxin X — high activity and unique substrate specificity. Sci Rep., 8(1): 4518. doi: 10.1038/s41598-018-22842-4.

Н.О. Савельєва-Кулик,
Редакція журналу «Український медичний часопис»