Содержание некодирующих микроРНК в плазме крови, тромбоцитах и моноцитах больных острым инфарктом миокарда

Введение

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение процессов, связанных с изменениями уровней некодирующих короткоцепочечных рибонуклеиновых кислот — микроРНК в различных биологических средах организма в качестве диагностического и прогностического маркера острого инфаркта миокарда (ОИМ) (Salic K., De Windt L.J., 2012; Deddens J.C. et al., 2013). В ряде публикаций установлена диагностическая ценность изменений в плазме крови следующих микроРНК: miR-1, miR-133, miR-208a, miR-499p (Wang G.K. et al., 2010; Salic K., De Windt L.J., 2012; Deddens J.C. et al., 2013). При подкупающей однозначности выводов исследователей отметим, что ни в одной из этих работ не подтверждены данные других ученых. Каждая исследовательская группа настаивает на диагностической значимости определенной микроРНК, фактически опровергая результаты друг друга (Li C. et al., 2013; Nabiałek E. et al., 2013). Это вызывает особенное удивление, поскольку во всех указанных работах применяли аналогичные методологические подходы — на первом этапе проводили «microarray assay» — микрозабор материала РНК — для скрининга микроРНК на ограниченном количестве пациентов или на пуле образцов плазмы крови от нескольких участников (больных и лиц контрольной группы). На следующем этапе проводили верификацию полученных данных путем оценки уровня нескольких микроРНК у множества пациентов с ОИМ с помощью методики «realtime PCR» — полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени — (miRNA TaqMan-assay), а на последнем этапе проводили верификацию данных генетического исследования в сравнении с традиционными лабораторными методами диагностики ОИМ (тропонин- Т, тропонин- I, МВ-КФК). Помимо противоречий относительно диагностического и клинического значения микроРНК, возникает целый ряд вопросов фундаментального характера. Имеет ли биологический смысл изменение уровня микроРНК в крови при ОИМ? Свидетельствует ли повышение уровня микроРНК лишь о выходе мышечно-специ­фических микроРНК из некротизированных кардиомиоцитов или имеет место секреция определенных микроРНК клетками сердца и эндотелия сосудов в ответ на ишемию миокарда, направленная на передачу сигнала от поврежденного миокарда к другим органам? Проникают ли микроРНК из плазмы крови в клетки и ткани других органов, влияют ли они на экспрессию таргетных генов? Большинство современных исследователей склонны трактовать повышение уровня определенных микроРНК в крови по аналогии с интерпретацией данных классических маркеров повреждения миокарда, указанных выше (Long G. et al., 2012). Однако такой логический ряд неизбежно приводит к невозможности объяснить малую информативность повышения микро­РНК-1 в плазме крови больных ОИМ, которая составляет более 40% всех микроРНК в кардиомиоцитах. Как ни странно, уровень микроРНК-1 в плазме крови находится у больных ОИМ на крайне низком уровне в сравнении с другими подтипами (например микро­РНК-499, который в кардиомиоцитах, наоборот, значительно уступает уровню экспрессии микроРНК-1) (Corsten M.F. et al., 2010).

С учетом противоречивых и неоднозначных данных цель настоящего исследования — определение у больных с острым коронарным синдромом (ОКС) с подъемом сегмента ST уровня ряда кардиоспецифических микроРНК (-1, -208a, -499), а также микроРНК, участвующих в патогенезе прогрессирования атеросклеротического процесса (-155 и -210) в плазме крови, изолированных моноцитах и тромбоцитах.

Объект и методы исследования

В исследование включили 20 больных в возрасте 38–74 лет (средний возраст — 54,85±2,2 года) с диагнозом «острый коронарный синдром (ОКС) с подъемом сегмента ST» (из них — 80% мужчин), гос­питализированных в ННЦ «Институт кардиологии имени академика Н.Д. Стражеско» НАМН Украины были исследованы. Информированное согласие на участие в исследовании получено у всех пациентов. Диагноз ОКС основывался на оценке Рекомендаций Европейского общества кардиологов и Американской коллегии кардиологов (Task Force on the management of ST-segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology (ESC) et al., 2012; Jneid H. et al., 2012). Основные характеристики пациентов, включенных в исследование, представлены в табл. 1.

Отбор крови и выделение клеток

Сначала выделяли плазму крови, затем клетки. С целью выделения тромбоцитов венозную кровь набирали в стерильных условиях в моноветы в объеме 2,7 мл с кальциевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (11,7 мМ) в качестве антикоагулянта («Sarstedt», Германия), с целью предупреждения адгезии и агрегации тромбоцитов использовали апиразу (1 ЕД/мл). Выделение тромбоцитов проводили в три этапа:

• центрифугирование (100 г) цельной крови в течение 5 мин (супернатант содержал тромбоциты и моноциты);
• центрифугирование (400 г) в течение 2 мин;
• центрифугирование (900 г) в течение 6 мин с развитием ресуспензирования тромбоцитов в буфере Тироде — (137 ммоль хлорида натрия (NaCl), 12 ммоль гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), 2 ммоль хлорида калия (KCl), 0,34 ммоль гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄), 1 ммоль хлорида магния (MgCl₂), 5,5 ммоль глюкозы, 5 мМоль HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N`-2-этансульфоновая кислота), pH 7,3), содержащем 0,35% альбумина в сыворотке крови. Подсчет количества тромбоцитов проводили в камере Горяева.

Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени

Изоляцию микроРНК осуществляли при поступлении больного в стационар. Общее число РНК получено с использованием набора «mirVana PARIS kit» (Ambion, США), концентрацию РНК определяли по данным спектрофотометрии («NanoDrop ND1000», NanoDrop Technologies Inc., США). Обратную транскрипцию осуществляли с помощью коммерчески доступных наборов («High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit», Applied Biosystems, США), специфических петлевых праймеров для каждой микроРНК, малых ядерных U6 РНК (эндогенный контроль) и 10 нг РНК в качестве внутреннего контроля. Количественная ПЦР в режиме реального времени (Quantitative realtime polymerase chain reaction — PCR) применена с использованием «PCR thermal cycler» («7500 Fast Real-time PCR System», Applied Biosystems, USA) и «TaqMan MicroRNA assays» (Applied Biosystems, USA). «Нsa-miR-1» (assay ID 002222), «Hsa-miR-155» (assay ID 002623), «Hsa-miR-208a» (assay ID 000511), «Нsa-miR-208b» (assay ID 002290), «Нsa-miR-210» (assay ID 000512), «Нsa-miR-499» (assay ID 001352), «U6 snRNA» (assay ID 001973). Полученные результаты исследованы с помощью программного обеспечения «7500 Fast Real-time PCR software» («Applied Biosystems», США).

Статистический анализ

Все данные представлены в виде арифметических данных (средние значения ± SEM). Результаты анализа во всех группах тестированы относительно оценки нормальности статистического распределения показателей с использованием теста Колмогорова — Смирнова и вариабельности данных по тесту ANOVА. Коэффициент корреляции Пирсона использован для оценки изменений уровней микроРНК. Статистический анализ произведен с использованием программы Excel 2007 («Microsoft Corporation», USA) and SPSS Statistics version 17.0 («IBM Corporation», USA).

Результаты и их обсуждение

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что при развитии острого некротического повреждения сердца (ОИМ) в первые 4 ч отмечают неоднозначные изменения микроРНК.

В плазме крови пациентов с ОИМ микроРНК-208а и -210 определяли значительно низкие уровни, у части больных — ниже уровня детекции. В плазме крови больных в первые часы ОИМ проведен анализ только следующих микроРНК: -1, -155, -499. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Уровни микроРНК-1 и микроРНК-499 в плазме крови больных ОИМ не отличались от концентраций в плазме крови у пациентов контрольной группы и соответственно составили 1,00±0,42 против 0,80±0,31 (р=0,78), для микроРНК-1 и 37,44±16,92 против 36,08±21,7 (р=0,84) — для микро­РНК-499. Уровень микроРНК-155 был выше в группе контроля в сравнении с группой ОИМ и составил соответственно 12,82±2,72 против 2,70±0,78 (p<0,05).

В изолированных тромбоцитах уровень микроРНК-1 был в 4,2 раза ниже в конт­рольной группе в сравнении с группой больных ОИМ (24,75±10,44 против 105,07±28,46 соответственно; p<0,05).

Уровень микроРНК-155, -208а, -210, -499 в тромбоцитах был выше в группе больных ОИМ, но достоверных различий не выявлено (табл. 3).

В моноцитах крови больных в первые часы ОИМ отмечали более высокие значения микроРНК в сравнении с контрольной группой (табл. 4). Содержание микроРНК-1 в контрольной группе было в 32,2 раза ниже в сравнении с группой ОИМ (0,07±0,05 против 2,26±0,91; p=0,11). Наиболее значимые различия отмечали при измерении уровня микроРНК-155 (2,20±0,78 против 37,18±11,49 в группе больных ОИМ; p<0,01).

Уровень микроРНК-208а соответствовал крайне низким значениям и практически был сопоставим в обеих группах (0,013±0,004 против 0,015±0,004; p=0,73).

Уровень микроРНК-210 в контрольной группе был в 9 раз ниже в сравнении с группой больных ОИМ (1,86±0,90 против 17,23±7,70 соответственно; p=0,17).

При определении уровня микро­РНК-499 выявлены более низкие значения в группе контроля в сравнении с группой больных ОИМ (7,59±2,21 против 43,77±17,39 соответственно; p=0,08).

Анализ полученных данных не продемонстрировал ожидаемого повышения «кардиоспецифической» микроРНК-1 в плазме крови, при этом концентрации микроРНК-208а были ниже уровня детекции, равно как и уровень микроРНК-210. Вместе с тем вследствие значительного разброса значений достоверных изменений в сравнении с группой контроля уровня микроРНК-499 не отмечали. Следует отметить, что уровень микроРНК-155 в первые часы ОИМ в плазме крови (см. табл. 2) был достоверно ниже, чем в контрольной группе (в 4,74 раза; р=0,0001). Таким образом, наиболее показательными являются данные относительно колебаний уровня микроРНК-155 в плазме крови, что не согласуется с результатами, полученными S. Matsumoto и соавторами (2012) при оценке уровня микроРНК не в плазме, а в сыворотке крови. Согласно данным японских ученых, уровень микроРНК-155 повышался при ОИМ и ассоциировался с увеличением риска сердечно-сосудистой смерти в течение 1 года после ОИМ. При этом отмечено, что большинство пациентов в исследовании были госпитализированы в течение 12 ч от начала проявления симптомов ОИМ (в среднем — через 3,8 ч).

МикроРНК-155 относят к регуляторам неспецифического иммунного ответа (innate immunity), острая воспалительная реакция, как известно, является одним из патогенетических звеньев ОКС и ОИМ. Согласно данным словенских ученых, которые определяли уровень микроРНК указанного типа в аутопсическом материале миокарда больных ОИМ, ее уровень значительно повышается при ОИМ, причем в наибольшей степени у больных без разрыва миокарда (Zidar N. et al., 2011). Таким образом, можно предположить, что снижение уровня микроРНК-155 в первые часы ОКС в плазме крови может свидетельствовать об активации иммунного ответа, острой воспалительной реакции вследствие повышения экспрессии генов, контролируемых данной микроРНК.

При исследовании изменений уровня микроРНК в изолированных тромбоцитах мы обратили внимание на значительно более высокий уровень микроРНК в изолированных клетках в сравнении с плазмой крови. В целом это позволяет предположить, что определение уровня микроРНК при ОИМ целесообразней проводить в изолированных клетках крови, что повышает надежность и чувствительность анализа. Достоверные изменения в изолированных тромбоцитах наблюдали лишь относительно уровня микроРНК-1, который повышался при развитии ОКС в 4,5 раза в сравнении с контролем, и в 100 раз превышал содержание данной микроРНК в плазме крови больных в первые часы ОКС.

Как известно, микроРНК-1 является доминирующей среди кардиоспецифических микроРНК (уровень экспрессии превышает 40% всех микроРНК клеток сердца), что позволяет предполагать, что некроз кардиомиоцитов при ишемии будет способствовать выходу микроРНК-1 в циркулирующую кровь. Однако, по нашим данным, ее содержание в плазме крови в 100 раз ниже, чем в тромбоцитах. При этом следует сделать поправку на значительное количество изолированных клеток, использованных для выделения РНК (10–140 ● 10⁶/мл). Косвенно этот факт может свидетельствовать о поступлении микроРНК из плазмы крови в тромбоциты и истощении ее запасов в плазме крови.

Биологический смысл этого явления остается неясным, может ли влиять микро­РНК-1 на экспрессию генов в тромбоцитах также неизвестно, однако диагностическое преимущество определения уровня этой микроРНК в тромбоцитах при ОИМ представляется несомненным. Кроме того, низкий уровень исследуемых микроРНК в плазме крови может быть обусловлен применением гепарина и его производных (низкомолекулярного гепарина, пентасахарида фондапаринукса) в ранние сроки ОКС — на догоспитальном или раннем гос­питальном этапе (Kaudewitz D. et al., 2013). В подобной ситуации наиболее устойчивым и, соответственно, диагностически значимым может быть внутриклеточный пул микро­РНК. Но и тогда остается открытым вопрос о природе повышения содержания внутриклеточной микроРНК-1. Аналогичное увеличение содержания в тромбоцитах в сравнении с таковым в плазме крови получено для микроРНК-155 (2,70 — в плазме и 226,5 — в тромбоцитах). При этом имела место обратная картина, когда «кардиоспецифическая» микроРНК-499, лишь незначительно представленная в плазме крови больных в первые часы ОИМ (36,08±21,7 против 37,4±16,9 в контроле; р=0,84), в тромбоцитах содержалась еще в меньшем количестве (р=0,08). Это может служить опровержением концепции, что выделившиеся из миокарда при его повреждении «кардиоспецифические» микроРНК напрямую мигрируют в клетки крови. Хотя подобный механизм не исключен для других микроРНК. Следует отметить, что такие микроРНК, как -208 и -210, практически не идентифицированы в нашем исследовании в плазме крови больных ОИМ, в тромбоцитах выявляли, но в минимальных содержаниях, достоверно не отличавшихся от контрольных значений (см. табл. 3).

Заслуживают внимания, по нашему мнению, данные, полученные при определении уровня микроРНК в моноцитах крови. Прежде всего, следует указать на гораздо более высокий уровень практически всех исследованных микроРНК в этих клетках, что отчасти объясняется выделением (изоляцией) значительного количества моноцитов из периферической крови (0,42–9,0 ● 10⁶/мл).

Наиболее выраженные, но недостоверные вследствие значительного разброса показателей, повышения уровней микроРНК в моноцитах крови больных в ранние сроки ОИМ в сравнении с группой контроля наблюдали для микроРНК-1 (2,27±0,9 против 0,08±0,05 в контроле; р=0,1), микроРНК-210 (128,5±47,4 против 58,1±17,7 в контроле; р=0,29), микро­РНК-499 (44,2±17,3 против 27,5±10,9 в контроле; р=0,43).

Для микроРНК-208а отмечены самые низкие значения как в моноцитах (0,015±0,0049), так и в тромбоцитах (0,12±0,06). Это не позволяет рассматривать указанные микроРНК в качестве диагностически значимых маркеров повреждения миокарда на ранних стадиях развития ОИМ. Единственной из исследуемых микро­РНК, содержание которой было достоверно повышено в сравнении с контролем в изолированных моноцитах, была микроРНК-155 (37,2±11,4 против 2,21±0,78 в контроле; р=0,048). При этом отмечали обратную зависимость — ее низкое содержание в плазме крови (достоверное снижение по сравнению с контролем) в первые часы развития ОИМ сочеталось с повышенным содержанием данной микроРНК в тромбоцитах и моноцитах крови. Данный факт нуждается в уточнении — является ли повышение этой микроРНК в клетках результатом ее внутриклеточного образования и созревания или этапом захвата из плазмы крови для дальнейшего метаболизма. По нашему мнению, высказанное предположение можно в будущем верифицировать по факту выявления в клетках-предшественниках из костного мозга «незрелых» форм микроРНК, что позволит определить возможные механизмы транспорта некодирующих РНК в плазме крови, изолированных тромбоцитах и моноцитах, а также исследовать дополнительную роль клеток крови в качестве регулятора биологических процессов при повреждении тканей. Снижение уровня микроРНК-155 в плазме крови больных ОИМ также наблюдали в исследовании R. Yao и соавторов (2011), при этом уровень микроРНК в плазме крови тесно коррелировал с уровнем этой же микроРНК в мононуклеарах периферической крови (включающих моноциты), что не нашло подтверждения в нашем исследовании. Известно, что микро­РНК-155 принимает участие в патогенезе атеросклероза, препятствует синтезу белка, подавляющего воспалительную реакцию и, таким образом, при низких его концентрациях способствует прогрессированию процесса. Однако, согласно данным, полученным в эксперименте, сама по себе микроРНК-155 не может служить инициатором воспаления, ее индуцирует другая микроРНК-342–5p, которая постоянно продуцируется макрофагами, с возрастанием уровня экспрессии при воспалении. Результаты немецких ученых ставят под сомнение прямую связь между активацией воспалительного процесса и уровнем микроРНК-155 (Wei Y. et al., 2013).

В другом экспериментальном исследовании продемонстрирована связь низкой концентрации микроРНК-155 с прогрессированием атеросклероза, а также дестабилизацией атеросклеротической бляшки (Donners M.M. et al., 2012). Проведенный анализ позволяет сделать вывод, что изменение уровня микроРНК-155 в клетках крови является новым перспективным маркером повреждения миокарда при развитии ОКС, характеризующим ответ иммунной системы. Для выяснения прогностического значения определения микроРНК-155 целесообразна оценка ее содержания в динамике патофизиологических стадий течения ОИМ, включая период активации процессов репарации, совпадающих по времени с клинической стадией подострой фазы заболевания (2–3-я недели ОИМ).

Выводы

Определение уровня микроРНК является новым перспективным методом оценки активности патофизиологических процессов, в том числе при кардиоваскулярной патологии.

Частота выявления изменения экспрессии некодирующих микроРНК при ОКС обусловлена субстратом исследования (плазма крови или клетки периферической крови) — морфологический материал в данном исследовании не оцени­вали.

Результаты исследования отражают потенциальную клиническую значимость определения повышенного уровня моноцитарной микроРНК-155 в ранней диагностике поражения миокарда при ОКС при отсутствии изменений ранних маркеров поражения миокарда.

Полученные данные о статистически достоверных различиях содержания микро­РНК в плазме крови и ее клеточных элементах (тромбоцитах, моноцитах) свидетельствуют о необходимости разработки новых методов диагностики и прогнозирования после успешных интервенционных вмешательств при ОКС.

Список использованной литературы

• Corsten M.F., Dennert R., Jochems S. et al. (2010) Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease. Circ. Cardiovasc. Genet., 3(6): 499–506.
• Deddens J.C., Colijn J.M., Oerlemans M.I. (2013) Circulating MicroRNAs as Novel Biomarkers for the Early Diagnosis of Acute Coronary Syndrome. J. Cardiovasc. Transl. Res., 6(6): 884–898.
• Donners M.M., Wolfs I.M., Stöger L.J. et al. (2012) Hematopoietic miR155 deficiency enhances atherosclerosis and decreases plaque stability in hyperlipidemic mice. PLoS One, 7(4): e35877.
• Jneid H., Anderson J.L., Wright R.S. et al. (2012) 2012 ACCF/AHA focused update of the guideline for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction (updating the 2007 guideline and replacing the 2011 focused update): a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. Am. Coll. Cardiol., 60(7): 645–681.
• Kaudewitz D., Lee R., Willeit P. et al. (2013) Impact of intravenous heparin on quantification of circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Thromb. Haemost., 110(3): 609–615.
• Li C., Fang Z., Jiang T. et al. (2013) Serum microRNAs profile from genome-wide serves as a fingerprint for diagnosis of acute myocardial infarction and angina pectoris. BMC Med. Genomics, 6:16.
• Long G., Wang F., Duan Q. et al. (2012) Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction. Int. J. Biol. Sci., 8(6): 811–818.
• Matsumoto S., Sakata Y., Nakatani D. et al. (2012) A subset of circulating microRNAs are predictive for cardiac death after discharge for acute myocardial infarction. Biochem. Biophys. Res. Commun., 427(2): 280–284.
• Nabiałek E., Wańha W., Kula D. et al. (2013) Circulating microRNAs (miR-423-5p, miR-208a and miR-1) in acute myocardial infarction and stable coronary heart disease. Minerva Cardioangiol., 61(6): 627–637.
• Salic K., De Windt L.J. (2012) MicroRNAs as biomarkers for myocardial infarction. Curr. Atheroscler. Rep., 14(3): 193–200.
• Task Force on the management of ST-segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology (ESC), Steg P.G., James S.K. et al. (2012) ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation. Eur. Heart J., 33(20): 569–619.
• Wang G.K., Zhu J.Q., Zhang J.T. et al. (2010) Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans. Eur. Heart J., 31(6): 659–666.
• Wei Y., Nazari-Jahantigh M., Chan L. et al. (2013) The microRNA-342-5p fosters inflammatory macrophage activation through an Akt1- and microRNA-155-dependent pathway during atherosclerosis. Circulation, 127(15): 1609–1619.
• Yao R., Ma Y., Du Y. et al. (2011) The altered expression of inflammation-related microRNAs with microRNA-155 expression correlates with Th17 differentiation in patients with acute coronary syndrome. Cell Mol. Immunol., 8(6): 486–495.
• Zidar N., Boštjančič E., Glavač D., Stajer D. (2011) MicroRNAs, innate immunity and ventricular rupture in human myocardial infarction. Dis. Markers, 31(5): 259–265.

Адрес для переписки:
Пархоменко Александр Николаевич
03151, Киев, ул. Народного ополчения, 5
Национальный научный центр
«Институт кардиологии имени академика Н.Д. Стражеско» НАМН Украины,
отдел реанимации и интенсивной терапии
E-mail: [email protected]