Хемокінові рецептори CCR4 та CXCR3 на Т-лімфоцитах у хворих на атопічний дерматит та псоріаз

ВСТУП

Захворюваність на атопічний дерматит (АД) у світі сягає 15 та більше випадків на 1000 населення і має тенденцію до зростання. За даними ВООЗ, на АД щорічно захворює до 1 млн осіб (Рыжко П.П. и соавт., 2005). Захворюваність серед населення різних країн становить не менше 5–10%, а в індустріально розвинутих країнах сягає 20% (Кутасевич Я.Ф., Олейник И.А., 2005). У загальній структурі дерматологічної захворюваності питома вага цієї патології становить 10–20% (Буянова О.В., Василюк О.Я., 2005). Частота схильності до атопії зросла протягом останніх десятиріч настільки, що в індустріально розвинутих країнах АД вважають однією з головних проблем охорони здоров’я (Negele K. et al., 2004). Так, у 2003 р. в Україні зареєстровано 76 225 випадків АД, в тому числі 46 627 — у дітей. Зростання захворюваності на АД та досить висока резистентність до загальноприйнятої терапії потребує докладного розгляду па­тогенезу цього дерматозу (Степаненко В.І. та співавт., 2005). АД зазвичай асоційований з імуноглобуліном Е (IgE) антитілозалежними механізмами. У більшості пацієнтів з АД виявляють гіперпродукцію IgE. IgE-залежні реакції пізньої фази можуть впливати на хронічну запальну відповідь при АД. Звичайно, що головну роль у наявності схильності до АД відіграє спадковість. Але зростання захворюваності на АД на сучасному етапі свідчить про комплексний вплив чинників навколишнього середовища та генетичної схильності на клінічні прояви захворювання. Імунологічні «мішені» у різних людей неоднакові та складаються з різних харчових, повітряних алергенів, подразнювальних речовин, гормонів, впливу стресу, клімату та мікроорганізмів (Abramovits W., 2005). Хоч остаточно патогенез АД ще не з’ясований, але встановлено властиві для нього імунологічні порушення. Припускають, що активація Т-лімфоцитів-хелперів, вивільнення медіаторів запалення та цитокінів з тучних клітин, спричинена алергією активація клітин Лангерганса та лімфоцитів беруть участь у патогенезі АД і призводять до хронічних запальних уражень шкіри у пацієнтів з АД (Lu­govic L. et al., 2005). Отже, незважаючи на прогрес у розумінні імунологічних феноменів, пов’язаних з АД, патогенез цього дерматозу залишається нез’ясованим (Simon D. et al., 2004). Теза щодо центральної ролі активованих Т-лімфоцитів у розвитку імунного запалення при АД спонукала ­науковців ретельно досліджувати їх функції та властивості. Так, було встановлено, що Т-лімфоци­ти-хелпери при АД проявляють властивості Т-лімфоцитів-хелперів другого типу (Th2), тобто переважно продукують характерні для цього типу імунної відповіді цитокіни (Vestergaard C. et al., 2003). Властива для АД міграція Т-лімфоцитів до місць запалення привернула увагу дослідників до хемокінів та їх рецепторів, що за сучасними уявленнями відіграють ключову роль у міграції лейкоцитів (Kawada K. et al., 2004). Відомо, що хемо­кіни та їх рецептори є важливими елементами вибіркового залучення та активації різних субпопуляцій лейкоцитів. При цьому експресія CXC хемокінового рецептора 3 (CXCR3) призводить до переважання Th1-, у той час як експресія СС хемокінового рецептора 4 (CCR4) — до переважання Th2-типу імунної відповіді (Shimada Y. et al., 2004). За результатами досліджень більшість Т-лімфоцитів-хелперів, позитивних за CCR4, продукують інтерлейкін-4, а позитивних за CXCR3 — інтерферон-гамма, тобто головні маркери Th1- та Th2-імун­ної відповіді (Inaoki M. et al., 2003). Виходячи з превалювання Th2 при АД, зазначені хемокінові рецептори, ймовірно, мають важливе значення при цьому хронічному дерматозі. CXCR3 — рецептор для інтерферон-гамма індуцибельних хемокінів CXCL9, CXCL10 та CXCL11, зв’язаний з G-протеїном. CXCR3 експресується на активованих імунних клітинах (переважно на Т-лімфоцитах) та клітинах проліферуючого ендотелію (Colvin R.A. et al., 2004; Jiang D. et al., 2004). CCR4 — зв’язаний із G-протеїном трансмембранний рецептор для CCL2, CCL5, CCL17, CCL22, який переважно експресується на Th2 (Maeda S. et al., 2002). Виходячи з постулату, що АД є захворюванням з превалюванням Th2-типу імунної відповіді, саме CCR4 вважається важливою ланкою патогенезу цього захворювання (Tsunemi Y. et al., 2004).

На відміну від АД, хронічним запальним захворюванням з переважанням Th1-типу імунної відповіді є псоріаз (Vestergaard C. et al., 2003). Отже цілком логічним здається і важлива при псоріазі роль CXCR3, пов’язаного саме з Th1-типом імунної відповіді, який забезпечує міграцію активованих Th1 (McColl S.R. et al., 2004). Проте переважання певного типу імунної відповіді при тому чи іншому захворюванні не може повністю виключити можливості впливу іншого, тобто пригніченого типу імунної відповіді у розвитку та підтриманні цієї хвороби. Так, існують дані щодо участі цитокінів, властивих Th1-типу імунної відповіді, у патогенезі АД (Shimada Y. et al., 2004). Водночас встановлено підвищений рівень CCR4, властивого Th2-типу імунної відповіді, на CD8⁺-Т-лімфоцитах у периферичній крові хворих на псоріаз порівняно з таким у здорових донорів та підвищене співвідношення продукції CCR4 і CXCR3 на цих клітинах (Inaoki M. et al., 2003). Отже у патогенезі АД беруть участь і механізми, пов’язані з Th1-типом імунної відповіді, а при псоріазі кількість пов’язаних із Th2-типом імунної відповіді CCR4 на цитотоксичних Т-лімфоцитах навіть переважає таку властивих Th1-типу імунної відповіді CXCR3. Роль субпопуляцій цитотоксичних Т-лімфоцитів взагалі недостатньо ви­вчена, особливо при АД. Зазначені факти потребують порівняння експресії CXCR3 та CCR4 та їх співвідношення на Т-лімфоцитах-хелперах і цитотоксичних Т-лімфоцитах у хворих на АД та псоріаз, що дасть змогу краще зрозуміти характер імунологічних зрушень при цих хронічних дерматозах.

ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

За допомогою багатоколірної проточної цитометрії досліджено рівень експресії хемокінових рецепторів CCR4 та CXCR3 на CD3⁺-, CD3⁺CD4⁺– та CD3⁺CD8⁺-Т-лімфоцитах у периферичній крові 40 хворих на АД та 47 хворих на псоріаз. З метою уникнення впливу вікових особливостей при аналізі отриманих даних хворі на АД були розподілені на 2 групи за віком (діти та дорослі). Середній вік дорослих пацієнтів з АД становив 20,69±1,39 року, а дітей — 4,66±0,80 року, хворих на псоріаз — 40,64± 2,30 року.

Лімфоцитарні субпопуляції у цільній гепаринізованій периферичній крові визначали за методом триколірної проточної цитометрії з використанням моноклональних антитіл фірми «Becton Dickinson» (США) та цитометра «FACScan» («Becton Dickinson», США) з використанням комп’ютерних програм FACScan Research & Lysis software («Becton Dick­inson», США). 100 мкл крові переносили в окремі пробірки з 20 мкл кожного моноклонального антитіла. Після змішування інкубували при кімнатній температурі протягом 15–30 хв у темряві. Далі у кожну пробірку додавали 2 мл лізуючого розчину виробництва фірми «Becton Dickinson» та інкубували протягом 10 хв. Після цього проби центрифугували при 500 g протягом 5 хв і видаляли лізовані еритроцити. Після дворазової відмивки розчином CellWash («Becton Dickinson», США) клітини фіксували 1% роз­чином параформальдегіду та аналізували на цитометрі протягом 24 год. Для виключення з аналізу моноцитів, гранулоцитів, фрагментів клітин та нелізованих або ядерних еритроцитів кожен зразок крові хворих на псоріаз інкубували з LeucoGATE (анти-CD45 та анти-CD14), мічених флюоресцеїну ізотіоціанатом та фікоеритрином відповідно. Як фоновий контроль були використані Simultest Control (IgG₁, мічений флюоресцеїну ізотіоціанатом, та IgG₂, мічений фікоеритрином, «Becton Dickinson», США). Аналізували відносний рівень CD3⁺CXCR3⁺, CD3⁺CD4⁺CXCR3⁺, CD3⁺CD8⁺CXCR3⁺, CD3⁺CCR4⁺, CD3⁺CD4⁺CCR4⁺ та CD3⁺CD8⁺CCR4⁺. Для триколірної флоуцитометрії моноклональні антитіла були мічені флуорохромами: FITC (флюоресцеїну ізотіоціанат), PE (фікоеритрин) та PerCP (перидинін хлорофіл) виробництва «Becton Dickin­son», США.

З метою оцінки статистичної значущості різниці показників хворих на псоріаз від норми застосовували непарний t-тест з поправками Велча. Різницю показників вважали статистично значущою при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Отримані нами дані свідчать, що рівні експресії CXCR3 на Т-лімфоцитах у дорослих, хворих на АД та псоріаз, не відрізняються, але значущо знижені у дітей з АД. Рівень експресії CXCR3 на Т-лімфоцитах-хелперах найвищий у хворих на псоріаз, значущо нижчий у дорослих пацієнтів з АД та значущо нижчий у дітей з АД, ніж в обох групах дорослих пацієнтів. І навпаки: рівень експресії CXCR3 на цитотоксичних Т-лімфоцитах підвищений у дітей з АД порівняно з таким у хворих на псоріаз і не відрізняється від цього показника у дорослих, хворих на АД. Рівень експресії CCR4 на Т-лімфоцитах та Т-лімфоцитах-хелперах не відрізнявся у дітей та дорослих з АД, але був значущо зниженим порівняно з таким у хворих на псоріаз. Рівень експресії цього рецептора на цитотоксичних Т-лімфоцитах у хворих на псоріаз та дітей з АД не відрізнявся, але був значущо зниженим у дорослих з АД (табл. 1).

При аналізі співвідношення рівня експресії CXCR3 та CCR4 виявилося, що відносно Т-лімфоцитів таке співвідношення було значущо нижчим у дітей з АД порівняно з дорослими, хворими на АД. Щодо Т-лімфоцитів-хелперів таке співвідношення виявилося найвищим у хворих на псоріаз, значущо нижчим — у дорослих з АД, а також порівняно із зазначеними групами у дітей з АД. На цитотоксичних Т-лімфоцитах співвідношення CXCR3 та CCR4 не відрізнялося у хворих на псоріаз та дітей з АД, але у дорослих з АД це співвідношення виявилося значущо вищим (табл. 2).

Таблиця 2
Співвідношення продукції CXCR3 та CCR4 на Т-лімфоцитах,
Т-лімфоцитах-хелперах та цитотоксичних Т-лімфоцитах у хворих
на псоріаз та АД

Примітки: * p<0,05; *** p<0,001 (порівняно з хворими на псоріаз); ^† p<0,05;
^††† p<0,001 (порівняно з дорослими, хворими на АД).

Наші дані свідчать, що, незважаючи на переважання Th1-типу імунної відповіді при псоріазі, рівень експресії CCR4, властивої для Th2-типу імунної відповіді, не тільки не знижений, а й навіть значущо перевищує рівень експресії CCR4 при АД. Отже, можна казати про загальне підсилення імунної відповіді при псоріазі. На основі отриманих даних можна припустити, що схильність до інфекцій підвищена у хворих на АД (але не у хворих на псоріаз) через слабшу імунну відповідь.

При аналізі показників експресії хемокінових рецепторів у дітей з АД привертає увагу той факт, що саме у цій групі пацієнтів вплив Th1-типу імунної відповіді найнижчий. Це підтверджується як низьким рівнем продукції CXCR3, так і значенням співвідношення CXCR3 та CCR4 на Т-лімфоцитах-хелперах на користь останнього. Підвищення експресії CXCR3 у хворих на АД з віком та значуща зміна співвідношення CXCR3/CCR4 у бік CXCR3 свідчить про зростаючу з віком роль у них Th1-типу імунної відповіді. Таким чином, можна припустити, що превалювання дитячого населення у структурі хворих на АД пояснюється саме найбільшим впливом Th2-типу імунної відповіді в організмі дитини, який поступово послаблюється, що ймовірно приводить у більшості таких хворих до одужання. Це підтверджується зменшенням частки АД у дорослій популяції.

Особливої уваги заслуговує аналіз отриманих даних щодо експресії CXCR3 та CCR4 на субпопуляції цитотоксичних Т-лімфоцитів. Нині дуже мало відомо про участь цих клітин у патогенезі псоріазу й АД та їх властивості. Є дані щодо підвищення продукції CCR4 на цитотоксичних Т-лімфоцитах у периферичній крові хворих на псоріаз порівняно з такою у здорових донорів та щодо збільшення співвідношення продукції CCR4 та CXCR3 на цих клітинах (Inaoki M. et al., 2003). При порівнянні продукції CXCR3 та CCR4 і їх співвідношення на цитотоксичних Т-лімфоцитах нами встановлено майже зворотний механізм їх продукції порівняно з Т-лімфоцитами-хелперами. Так, продукція CXCR3 на цитотоксичних Т-лімфоцитах у дітей з АД значущо підвищена, а CCR4 — у дорослих з АД значущо знижена. Співвідношення CXCR3 і CCR4 на цитотоксичних Т-лімфоцитах свідчить про переважання продукції CCR4 при псоріазі та CXCR3 при АД відповідно. Отже, можна припустити наявність певної протилежності продукції хемокінових рецепторів Т-хелперами і цитотоксичними Т-лімфоцитами при псоріазі та АД. Можливо, саме Т-цитотоксичні лімфоцити є резервною системою підтримання балансу в організмі. Особливого практичного значення ці припущення набувають у зв’язку з широким застосуванням «біологічних» препаратів. З наведеного вище стає зрозумілим, що навіть виключення відомих Th1- та Th2-механізмів імунного запалення може виявитися недостатнім для вилікування псоріазу та АД у зв’язку з наявністю в організмі резервних шляхів підтримання імунологічного запалення. У всякому разі подальше вивчення функцій та властивостей цитотоксичних Т-лімфоцитів може виявитися доцільним з точки зору розуміння патогенезу хронічних імунозалежних дерматозів та їх лікування.

ВИСНОВКИ

Отримані нами дані про зниження експресії CXCR3 та CCR4 на Т-лімфоцитах-хелперах підтверджують, що у хворих на АД більш слабка імунна відповідь, чим може пояснюватися підвищена схильність до інфекцій. При цьому переважання Th2-типу імунної відповіді при АД є принциповим для розвитку алергічного процесу. Поступове послаблення з віком переважання Th2-типу імунної відповіді у дітей з АД ймовірно пояснює зменшення частки АД у дорослій популяції і зменшення схильності до інфекцій. При псоріазі нами виявлено підвищення експресії хемокінових рецепторів, властиве як Th1-, так і Th2-типу імунної відповіді зі значною перевагою на користь Th1. Тобто при псоріазі відбувається загальне посилення імунної відповіді, що пояснює зменшення схильності до інфекцій та підсилення протипухлинної резистентності.

Характер продукції хемокінів цитотоксичними Т-лімфоцитами у хворих на псоріаз та АД докорінно відрізняється від такої Т-лімфоцитами-хелперами і потребує подальшого вивчення, що може сприяти покращанню розуміння патогенезу та лікування хронічних імунозалежних дерматозів.

ЛІТЕРАТУРА

• Буянова О.В., Василюк О.Я. (2005) Нові підходи до лікування атопічного дерматиту. Укр. журн. дерматології, венерології, косметології, 2: 43–46.
• Кутасевич Я.Ф., Олейник И.А. (2005) Элидел: новая стратегия лечения атопического дерматита. Укр. журн. дерматології, венерології, косметології, 2: 37–42.
• Рыжко П.П., Сафонова Я.Н., Рощенюк Л.В. (2005) Рацио­нальность применения нового нестероидного крема элидел в лечении атопического дерматита. Укр. журн. дерматології, венерології, косметології, 1: 46–49.
• Степаненко В.І., Іщейкін К.Є., Рижко П.П., Кайдашев І.П. (2005) Імуносупресивна терапія при атопічному дерматиті. Укр. журн. дерматології, венерології, косметології, 1: 19–22.
• Abramovits W. (2005) Atopic dermatitis. J. Am. Acad. Dermatol., 53 (suppl. 1): 86–93.
• Colvin R.A., Campanella G.S., Sun J., Luster A.D. (2004) Intracellular domains of CXCR3 that mediate CXCL9, CXCL10, and CXCL11 function. J. Biol. Chem., 279(29): 30219–30227.
• Inaoki M., Sato S., Shirasaki F., Mukaida N., Takeha­ra K. (2003) The frequency of type 2 CD8+ T-cells is increased in peripheral blood from patients with psoriasis vulgaris. J. Clin. Immunol., 23(4): 269–278.
• Jiang D., Liang J., Hodge J., Lu B., Zhu Z., Yu S., Fan J., Gao Y., Yin Z., Homer R., Gerard C., Noble P.W. (2004) Regulation of pulmonary fibrosis by chemokine receptor CXCR3. J. Clin. Invest., 114(2): 291–299.
• Kawada K., Sonoshita M., Sakashita H., Takabayashi A., Yamaoka Y., Manabe T., Inaba K., Minato N., Oshima M., Take­to M.M. (2004) Pivotal role of CXCR3 in melanoma cell metastasis to lymph nodes. Cancer Res., 64(11): 4010–4017.
• Lugovic L., Lipozencic J., Jakic-Razumovic J. (2005) Prominent involvement of activated Th1-subset of T-cells and increased expression of receptor for IFN-gamma on keratinocytes in atopic dermatitis acute skin lesions. Int. Arch. Allergy Immunol., 137(2): 125–133.
• Maeda S., Okayama T., Omori K., Masuda K., Sakaguchi M., Ohno K., Tsujimoto H. (2002) Expression of CC chemokine receptor 4 (CCR4) mRNA in canine atopic skin lesion. Vet. Immunol. Immunopathol., 90(3–4): 145–154.
• McColl S.R., Mahalingam S., Staykova M., Tylaska L.A., Fisher K.E., Strick C.A., Gladue R.P., Neote K.S., Willen­borg D.O. (2004) Expression of rat I-TAC/CXCL11/SCYA11 during central nervous system inflammation: comparison with other CXCR3 ligands. Lab. Invest, 84(11): 1418–1429.
• Negele K., Heinrich J., Borte M., von Berg A., Schaaf B., Lehmann I., Wichmann H.E., Bolte G.; LISA Study Group (2004) Mode of delivery and development of atopic disease during the first 2 years of life. Pediatr. Allergy Immunol., 15(1): 48–54.
• Shimada Y., Takehara K., Sato S. (2004) Both Th2 and Th1 chemokines (TARC/CCL17, MDC/CCL22, and Mig/CXCL9) are elevated in sera from patients with atopic dermatitis. J. Dermatol. Sci., 34(3): 201–208.
• Simon D., Braathen L.R., Simon H.U. (2004) Eosinophils and atopic dermatitis. Allergy, 59(6): 561–570.
• Tsunemi Y., Sekiya T., Saeki H., Hirai K., Ohta K., Nakamu­ra K., Kakinuma T., Fujita H., Kagami S., Asano N., Tanida Y., Wakugawa M., Torii H., Tamaki K. (2004) Lack of association of CCR4 single nucleotide polymorphism with atopic dermatitis in Japanese patients. Acta Derm. Venerol., 84(3):187–190.
• Vestergaard C., Deleuran M., Gesser B., Gronhoj Lar­sen C. (2003) Expression of the T-helper 2-specific chemokine receptor CCR4 on CCR10-positive lymphocytes in atopic dermatitis skin but not in psoriasis skin. Br. J. Dermatol., 149(3): 457–463.

П.В. Чернышов