Исследование гликозилирования парапротеинов и анализ их электрофоретической подвижности у больных множественной миеломой

ВВЕДЕНИЕ

Множественная миелома (ММ) относится к наиболее распространенным злокачественным заболеваниям системы крови, частота которой неуклонно повышается. Интерес клиницистов вызывает прежде всего вторичный иммунодефицит, как правило, развивающийся у большинства больных с этой патологией. Изучение структуры их сывороточных поликлональных иммуноглобулинов и парапротеинов, в частности олигосахаридных цепей молекул IgG, позволяет более детально представить не только тонкости секреции этих белков, но и оценить последствия этого процесса.

Исследование углеводных компонентов иммуноглобулинов человека с помощью лектинов — один из методов, позволяющих регистрировать и оценивать вклад олигосахаридной цепи в структуру и функции антител.

Уникальное свойство лектинов, описанное основателем лектинологии, доктором Яном Коцуреком, — это способность связываться с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов. Это позволяет широко использовать препараты лектинов в экспериментальной биологии и медицине (Игнатов В.В., 1997). Лектинофермент­ный анализ — простой и доступный метод анализа состава олигосахаридной цепи иммуноглобулинов (Калинин Н.Л., Кулякина М.Н., 1998). Ранее мы предложили вариант этой методики, позволивший выявить различное гликозилирование молекул IgG у пациентов с инфарктом миокарда и сахарным диабетом (Ушаков А.В. и соавт., 2005), а также уста­новить факт идентичности двух различных парапротеинов у больного ММ (Ильясов Р.К. и соавт., 2006).

Имеющиеся в настоящее время данные литературы позволяют говорить о наличии при ММ моноклоновых B-лимфоцитов — предшественников опухолевых плазмоцитов. Поскольку опухолевые детерминанты выявлены на всех этапах дифференцировки B-лимфопоэза, следовательно, опухолевая трансформация при ММ происходит в отделе предшественников с возможностью «вызревания» в пределах опухолевого клона до миеломной клетки. Поэтому факт существования различных фенотипов B-лимфоцитов опухолевого клона скорее всего обусловлен остановкой роста на различных этапах B-клеточной дифференцировки. Это сопровождается накоплением клеток конкретной фенотипической характеристики и позволяет многим авторам рассматривать ММ как дифференцирующуюся ­B-клеточную опухоль (Голенков А.К., Шабалин В.Н.,  1995; Мошинская О.В., 1998). Учитывая, что различные фазы секреции иммуноглобулинов сопровождаются поэтапным присоединением углеводов для формирования полноценных олигосахаридных компонентов тяжелых и легких цепей (Литмен Г., Гуд Р., 1981), можно предположить, что прекращение синтеза полипептидной цепи на разных этапах ее сборки сопровождается также различной неполнотой формирования углеводных цепей.

Данных литературы, касающихся гликозилирования иммуноглобулинов при ММ, недостаточно. Тем не менее они позволяют понять общие тенденции этого процесса. То, что различные образцы миеломных IgG отличаются друг от друга своей неполнотой формирования углеводной цепи, было установлено сравнительно недавно (Mizuochi T. ­et al., 1982). Анализ электрофоретической подвижности иммуноглобулинов позволил выяснить, что молекулы IgG, богатые сиаловой кислотой, более подвижны, однако прямой зависимости между изменением заряда молекулы и присутствием сиаловой кислоты не выявлено (Готтшлак А., 1969). Группой авторов у больных миеломой выявлены на Fab-фрагментах IgG участки повышенного сиалирования и фукозилирования (Kinoshita N. et al., 1991). Другие исследователи предлагают рассматривать повышение сиалирования IgG как маркер малигнизации парапротеинемий (Fleming S.C. et al., 1998). Интересна публикация, описывающая отличие гликозилирования легких цепей парапротеинов при ММ; эти иммуноглобулины отличались также по электрофоретической подвижности (Goni F. ­et al., 1988). В одной из работ лектиноферментным методом проводился сравнительный анализ гликозилирования Fab– и Fc-фрагментов молекулы IgG у больных ММ; выявлено, что Fab-фрагменты наиболее гликозилированы с преобладанием фукозы, галактозы и сиаловой кислоты (Hajdukovic–Dragojlovic L. et al., 1997). Факты гликозилирования гипервариабельных областей иммуноглобулинов представляются нам более интересными, так как именно эти участки определяют конфигурацию антигенсвязывающего участка и его комплементарность конкретной антигенной детерминанте (Андреева Н.Е., Чернохвостова Е.В., 1985).

Поликлональный IgG — это пул гетерогенных иммуноглобулинов, отличающихся множеством признаков: специфичностью, антигенными свойствами, молекулярным весом и зарядом. Два последних фактора являются определяющими в регуляции подвижности белков в электрическом поле. Извест­но, что изоэлектрическая точка (pI) нормальных, поликлональных иммуноглобулинов класса G находится в диапазоне от 5 до 8,5. Множество молекул IgG можно разделить на две группы иммуноглобулинов с различными подфракциями Fab-фрагмента, мигрирующие во время электрофореза к аноду также по-разному: более «мобильные», кислые и более «медленные», щелочные. Большинство парапротеинов имеют pI выше 7 (Кирюхина Д.Н., Кирюхин И.Ф., 1974; Блумберга И.А., 1976).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены результаты исследований 40 больных ММ, проходящих лечение в отделении гематологии Крымского республиканского клинического онкологического диспансера. Из них 29 больных с парапротеином класса IgG и 11 — класса IgA. Все пациенты имели в той или иной степени выраженности классические проявления этой болезни: гиперпротеинемия, протеинурия, остеодеструкция, высокая СОЭ и плазмоцитоз. Пробы крови брались натощак из периферической вены в первые сутки поступления в клинику. В исследование не включались больные с сопутствую­щей патологией, чтобы исключить другие факторы, влияющие на иммунную си­стему.

Исследование сыворотки крови больных на наличие М-градиента проводили методом электрофореза и иммуноэлектрофореза в геле агара (Фримель Г., 1987). Гель агара (1,3%) готовился на 0,103 М трис-боратном буферном растворе, pH 9,2. В качестве контроля использовали сыворотку крови здорового человека и больного ММ с выраженной парапротеинемией.

Парапротеины и поликлональная фракция IgG из сыворотки крови больных ММ, а также препарат IgG из смеси сывороток крови здоровых людей были получены следующим образом. Осадок фракции глобулинов, полученной высаливанием 17,5% (NH4)2SO4, отделялся центрифугированием (6000 g,­ 30 мин), затем был растворен в 0,005 М фосфатном буферном растворе, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,4 (PBS) и диализован против 0,025 М трис-НCl буферного раствора, содержащего 0,035 М NaCl, рН 8,8. Элюцию проб IgG осуществляли с помощью того же буферного раствора методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Трисакриле М (LKB, Швеция). Профиль элюции строили по значениям экстинкции собираемых проб при длине волны 280 нм. Измерение экстинкции проводили на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, СССР). Контроль чистоты выделенных парапротеинов и анализ их подвижности осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном на 0,001 М трис-глициновом буферном растворе, pH 8,3. Сравнительная оценка подвижности парапротеинов, основанная исключительно на анализе их молекулярной массы, проводилась методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (3,5–30%) в присутствии додецилсульфата натрия (Гааль Э. и соавт., 1982).

В качестве относительной величины электрофоретической подвижности парапротеинов в 7,5% ПААГ (l) взято отношение миграции парапротеина к подвижности альбуминовой фракции поликлонального IgG. При этом длина пробега учитывалась как расстояние от края лунки до среднеарифметической точки между ближним и дальним краями электрофоретического пятна того или иного белка (рис. 1).

Рис. 1. Диск-электрофорез в 7,5% полиакриламидном геле. 1 — контрольная сыворотка; 2–13 — парапротеины больных ММ

Класс парапротеинов и тип легких цепей определяли методами иммуноэлектрофореза (Грабар П., Буртэн П., 1963) и двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РИД) (Фридберг Ч.К., 1975) с использованием овечьих поликлональных моноспецифических антисывороток против IgG (H+L), IgG (H), IgA (H), IgM (H), а также против λ- и κ-цепей иммуноглобулинов человека (НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ, г. Нижний Новгород).

Степень взаимодействия лектинов с углеводными компонентами IgG оценивали нашим вариантом лектиноферментного анализа. На поверхность 96-луночного планшета (Costar, США) вносились (по 100 мкл в лунку) препараты исследуемых иммуноглобулинов в концентрации 1 мкг/мл в 0,05 М Nа-бикарбонатном буфере, рН 9,2. После тщательной промывки водой проводилась трехразовая (по 10 мин каждый раз) промывка лунок планшета 200 мкл раствора, содержащего 3,75 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Serva, Германия) в PBST (PBS, содержащий 0,025% твин 20 (Serva, Германия)): BSA+PBST. На следующем этапе вносили по 50 мкл раствора лектина гороха, конъюгированного с пероксидазой хрена (Лектинотест, Украина) в подобранном рабочем разведении в 0,003 М фосфатном буфере с 0,14 М NaCl и 0,003 М KCl, pH 7,4. Инкубацию лектина проводили в течение 1 ч при +37 °С. После стандартной промывки BSA+PBST в лунки вносили по 100 мкл субстратной смеси: 0,2 мМ ABTS (2, 2’-азино-ди-[3-этил-бензтиазолинсульфонат (6)]) в 0,05 М Na-цитратном буферном растворе, рН 4,0, содержащем 0,01% перекись водорода. Результат учитывали на спектрофотометре Multiskan (Titertek, Финляндия) при длине волны 405 нм. При этом рассматривались только данные тех рядов, в которых контрольные лунки демонстрировали минимальную оптическую плотность — от 0,03 до 0,085.

В данной работе преимущественно использовался лектин гороха, имеющий, как известно, высокое сродство к α-D-маннозе.

Относительная степень гликозилирования парапротеинов (∆E) оценивалась как разность экстинкций конечного раствора в ЛФА при взаимодействии с лектином гороха исследуемого парапротеина и контрольного поликлонального IgG, выделенного из смеси сывороток пятидесяти здоровых людей.

Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ Microsoft Excel (Windows XP). Данные в таблицах представлены в виде M±m, в диаграммах — M±σ. Различия оценивались по критерию Стьюдента (t) и считались достоверными при р<0,05. Анализ зависимости подвижности парапротеинов в электрическом поле и экстинкции конечного раствора в ЛФА (как критерий степени взаимодействия IgG с лектином гороха) проводился с учетом критических значений коэфицентов корреляции рангов (p) Спир­мена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ легких цепей методом РИД парапротеинов в группе больных IgG-миеломой показал, что у 17 больных этот патологический иммуноглобулин относился к классу IgG-κ, а у 12 — IgG-λ.

Результаты взаимодействия исследуемых парапротеинов IgG с лектином гороха позволили получить такое распределение: 10 парапротеинов демонстрировали более высокую по сравнению с контролем степень подобного взаимодействия, 19 парапротеинов — более низкую (рис. 2, табл. 1 и 2). При этом было замечено, что белки первой группы обладали большей электрофоретической подвижностью, чем второй.

Рис. 2. Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (Дон, белый столбик) и IgG-парапротеинами больных ММ (серые столбики). Данные лектиноферментного анализа. Е405 — экстинкция при длине волны 405 нм

Коэффициент ранговой корреляции между l и ∆E составил –0,59. При ошибке рангового коэффицента m=0,15 критерий Стьюдента (t) составил 3,67, что по таблице критических значений соответствует точности статистической достоверности выше 99% (р<0,01). Итак, между вышеуказанными параметрами — электрофоретической подвижностью и степенью взаимодействия с лектином гороха — выявлена отрицательная обратная корреляционная связь. На рис. 3 видно, что повышение показате­­­­­ля l ­сопровождается снижением ∆E.

Таблица 1 Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (усредненное значение принято за 100%) и IgG больных ММ.

Данные лектиноферментного анализа

* р<0,01, **p<0,001.

Таблица 2

Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (усредненное значение принято за 100%) и IgG больных ММ.

Данные лектиноферментного анализа

** p<0,001.

Рис. 3. Распределение пар показателей l и ∆E. Треугольным значком отображены пары с положительным значением ∆E, квадратным — с отрицательным. Условная вертикальная линия демонстрирует границу, за которой повышение l адекватно снижению ∆E ниже 0

С другой стороны, на изображении диск-электрофореза в градиенте ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 4) видно, что лишенные заряда молекулы парапротеинов имеют примерно одинаковую молекулярную массу и обладают сходной с контрольным иммуноглобулином подвижностью. Следовательно, основной вклад в подвижность исследуемых белков вносит заряд их молекул.

Другим объектом наших исследований стало изучение взаимодействия с лектином гороха сывороточного поликлонального IgG больных IgA-ми­еломой. Выявлено в большинстве случаев достоверное по сравнению с контрольной группой снижение экстинкции подобного взаимодействия (рис. 5).

Рис. 4. Диск-электрофорез в градиенте полиакриламидного геля (3–30%) в присутствии додецилсульфата натрия. 1 — контрольный IgG; 2–12 — парапротеины больных ММ

Рис. 5. Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (Дон) и IgG больных ММ с IgA-парапротеинемией. Данные лектиноферментного анализа. Е405 — экстинкция при длине волны 405 нм

Лектиноферментный анализ с применением других лектинов показал, что большинство парапротеинов, демонстрирующих более высокую по сравнению с контролем степень взаимодействия с лектином гороха, также более эффективно связываются с лектином картофеля (специфичность к β-N-ацетилглюкозамину), лектином арахиса (специфичность к β-D-галактозе) и с лектином пшеницы (специфичность к β-N-ацетилглюкозамину и N-ацетилнейраминовой кислоте). Напротив, парапротеины, показывающие в лектиноферментном анализе неэффективное взаимодействие с лектином гороха, с другими вышеуказанными лектинами демонстрируют такую же слабую степень взаимодействия (табл. 3). Причем подобный эффект был характерен не только для парапротеинов больных IgG-миеломой, но и для поликлонального IgG из группы больных IgA-миеломой.

Таблица 3

Взаимодействие различных лектинов с парапротеинами
в лектиноферментном анализе.

↑ и ↓ — повышение и понижение экстинкции по сравнению
с контролем

Поскольку именно заряд молекул парапротеинов является главным фактором, регулирующим их электрофоретическую подвижность, это означает, что к аноду быстрее будут мигрировать более электроотрицательные парапротеины, изоэлектрическая точка которых лежит в области «кислых» значений pH. Именно эта группа «мобильных» парапротеинов демонстрирует слабое взаимодействие с лектинами, а группа «медленных» молекул, напротив, имеет большое сродство к лектинам. Следовательно, можно предположить, что увеличение отрицательного заряда молекул патологических иммуноглобулинов сопровождается снижением их гликозилирования, во всяком случае уменьшением количества тех углеводных детерминант, которые доступны молекулам лектинов.

Как известно, синдром недостаточности нормальных поликлональных иммуноглобулинов является одним из последствий развития парапротеинемических гемобластозов, в частности при ММ. Уровень нормальных антител резко снижается, а по мере прогрессирования заболевания они могут полностью исчезнуть (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004). Среди большого количества теорий, объясняющих феномен вторичной иммунодепрессии особого внимания заслуживает экспериментальное выявление различными группами авторов иммуносупрессивного фактора, подавляющего пролиферацию иммуноглобулинов плазмоцитами, не затронутыми еще опухолевым процессом, а также приостанавливающего продукцию Ig на разных этапах после распознавания антигена (Андреева Н.Е., Чернохвостова Е.В., 1985). Полученные нами результаты по взаимодействию с лектинами поликлонального IgG больных с парапротеином класса A подтверждают, что подобные нарушения секреции иммуноглобулинов сопровождаются также дефектом их гликозилирования.

Интерес представляет не только сам факт изменения углеводных детерминант молекулы иммуно­глобулинов, но и разделение парапротеинов на две группы: с повышенным и пониженным показателем гликозилирования. Возможно, столь разная, диаметрально противоположная картина взаимодействия патологических иммуноглобулинов с молекулами лектинов объясняется различной скоростью секреции парапротеинов. Одни молекулы иммуно­глобулинов стремятся поскорее покинуть аппарат Гольджи и не успевают пройти весь цикл формирования полисахаридной цепи, а другие, наоборот, задерживаются в клетке и подвергаются дополнительному гликозилированию. Что касается различной изоэлектрической точки парапротеинов и связанного с этим различия в строении их углеводных детерминант, то пока трудно объяснить конкретные механизмы этого явления.

Поскольку большинство исследователей под гликозилированием парапротеинов подразумевают прежде всего изменение углеводных компонентов на Fab-фрагментах иммуноглобулинов и учитывая, что эта часть антител обладает антигенсвязывающей активностью, можно предположить, что эти изменения и коррелирующие с ними сдвиги изоэлектрической точки способны внести свой вклад в нарушение именно этой главной функции иммуно­глобулинов.

ВЫВОДЫ

1. У больных ММ обнаружено различное гликозилирование парапротеинов класса G: в одной группе больных количество углеводных детерминант, доступных лектину в ЛФА, больше, чем в контрольной группе, в другой, наоборот, меньше.

2. Выявлена отрицательная обратная корреляционная связь между уровнем взаимодействия парапротеинов с лектинами и их подвижностью в диск-электрофорезе в 7,5% ПААГ.

3. У большинства больных ММ (свыше 95%) с парапротеином IgA выявлено снижение гликозилирования (по степени взаимодействия с лектином гороха) поликлональных IgG по сравнению с контрольной группой.

4. Большинство исследованных парапротеинов (свыше 90%) демонстрируют с другими лектинами (картофеля, арахиса и пшеницы) идентичную лектину гороха степень взаимодействия.

ЛИТЕРАТУРА

Андреева Н.Е., Чернохвостова Е.В. (1985) Иммуноглобулинопатии. Медицина, Москва, 240 с.

Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М. (2004) Множественная миелома. Диалект, Санкт-Петербург, 448 с.

Блумберга И.А. (1976) Изоэлектрическая точка парапротеинов класса G у больных множественной миеломой. В кн.: Лейкозология, Вып. 5. Рига, с. 95–98.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. (1982) Электрофорез в разделении биологических макромолекул. Мир, Москва, 448 с.

Голенков А.К., Шабалин В.Н. (1995) Множественная миелома. Гиппократ, Санкт-Петербург, 144 с.

Готтшлак А. (1969) Гликопротеины. Мир, Москва, Т. 2., 300 с.

Грабар П., Буртэн П. (1963) Иммуноэлектрофоретический анализ. Иностранная литература, Москва, 212 с.

Игнатов В.В. (1997) Углеводузнающие белки — лектины. Соросовский образовательный журнал, 2: 14–20.

Ильясов Р.К., Паршкова Е.В., Петросян А.М., Ефе­тов К.А. (2006) Обнаружение IgG парапротеина в плевральном экссудате при множественной миеломе. Онкология, 8(1): 38–42.

Калинин Н.Л., Кулякина М.Н. (1998) Метод оценки углеводспецифичного взаимодействия иммуноглобулинов с биотинилированными лектинами. Прикладная биохимия и микробиология, 34(1): 66–69.

Кирюхина Д.Н., Кирюхин И.Ф. (1974) Методика изучения гетерогенности по изоэлектрическим точкам IgG, IgA и IgM в сыворотке крови человека. Лабораторное дело, 9: 549–551.

Литмен Г., Гуд Р. (1981) Иммунология. Мир, Москва, 496 с.

Мошинская О.В. (1998) Дайджест VI рабочего совещания по множественной миеломе (14–18 июня 1997 г., Бостон, Массачусетс, США). Укр. мед. часопис, 3(5): 73–76.

Ушаков А.В., Петросян А.М., Ефетов К.А. (2005) Гликозилирование иммуноглобулинов G человека при инфаркте миокарда и сахарном диабете. Таврический медико-биологический вестник, 8(4): 150–159.

Фридберг Ч.К. (1975) Иммунологические методы. Медицина, Москва, 320 с.

Фримель Г. (1987) Иммунологические методы. Медицина, Москва, 472 с.

Fleming S.C., Smith S., Knowles D., Skillen A., Self C.H. (1998) Increased sialylation of oligosaccharides on IgG paraproteins — a potential new tumour marker in multiple myeloma. J. Clin. Pathol., 51(11): 825–830.

Goni F., Chuba J., Buxbaum J., Frangione B. (1988) A double monoclonal IgG1 kappa and IgG2 kappa in a single myeloma patient. Variation in clonal products and therapeutic responses. J. Immunol., 140(2): 551–557.

Hajdukovic-Dragojlovic L., Nesic M., Cuperlovic K., Mov­sesijan M., Dovezenski N., Milosevic-Jovcic N., Jovanovic L. (1997) A study of human immunoglobulin (IgG and IgE) glycosylation by the interaction with lectins. Academic Press, San Diego, London, Boston, pp. 221–223.

Kinoshita N., Ohno M., Nishiura T., Fujii S., Nishikawa A., Kawakami Y., Uozumi N., Taniguchi N. (1991) Glycosylation at the Fab portion of myeloma immunoglobulin G and increased fucosylated biantennary sugar chains: structural analysis by high-performance liquid chromatography and antibody-lectin enzyme immunoassay using Lens culinaris agglutinin. Cancer Res., 51(21): 5888–5892.

Mizuochi T., Taniguchi T., Shimizu A., Kobata A. (1982) Structural and numerical variations of the carbohydrate moiety of immunoglobulin G. J. Immunol., 129(5): 2016–2020.

Адрес для переписки:

Петросян Армен Михаелович

95062, Симферополь, ул. Куйбышева, 31, кв. 14

Крымский государственный медицинский

университет им. С.И. Георгиевского,

кафедра патофизиологии

E–mail: gtrk@pop.cris.net