Вікова залежність динаміки активності нейтрофільних ефекторів вродженого імунітету у хворих на рак щитовидної залози після радіойодотерапії

Вступ

Відомо, що серед загальної кількості злоякісних захворювань частка раку щитовидної залози (РЩЗ) становить у середньому 0,5–3%. Проте незважаючи на відносну рідкісність та відносно сприятливий перебіг, діагностика та лікування РЩЗ привертає до себе увагу внаслідок зростання захворюваності та соціальної настороженості до променевої терапії в постчорнобильський період. Найбільш поширеним гістологічним типом диференційованого РЩЗ (ДРЩЗ) є папілярна (≈80% випадків) та фолікулярна (≈15% випадків) форми. Метастази папілярного РЩЗ здебільшого поширюються лімфогенним, а фолікулярного — гематогенним шляхом. Вважають, що наявність регіонарних метастазів підвищує смертність через 5 років у хворих із папілярною карциномою у 3,3 раза, з фолікулярною — у 7,6 раза. У хворих із фолікулярним РЩЗ ризик виникнення рецидиву на 80% вищий, ніж у пацієнтів із папілярним РЩЗ, а наявність регіонарних метастатичних уражень підвищує ризик на 40% (Берштейн Л.М., 2007; Мельниченко Г.А. и соавт., 2008).

Найчастіше ДРЩЗ виявляють у осіб віком <55 років (≈65%). У дітей та пацієнтів молодого віку ДРЩЗ має більш агресивний перебіг, хоча прогноз у них кращий. Встановлено, що найважливішими прогностичними факторами ДРЩЗ є наявність віддалених метастазів та вік пацієнта >45 років (Процик В.С. та співавт., 2000; Цыб А.Ф. и соавт., 2004).

Алгоритм лікування ДРЩЗ включає тиреоїдектомію, радіойодотерапію (РЙТ) та супресивну гормонотерапію L- тироксином. Використання РЙТ є найбільш ефективним засобом атрофії залишкової тканини ДРЩЗ із метою кращого виявлення і лікування регіонарних та віддалених метастазів. Радіойод у вигляді водного розчину натрію йодиду (Na¹³¹I) або в інкапсульованій формі при прийомі всередину добре накопичується резидуальною тканиною та високодиференційованими клітинами тиреоїдної карциноми. Руйнівну дію на клітини тиреоїдної карциноми здійснюють β-частки ¹³¹I, які у тканині мають невеликий пробіг (0,5–2,6 мм). Крім того, опромінення всього тіла, і зокрема периферичної крові, відбувається за рахунок глибоко проникаючих γ-квантів, ушкоджувальна дія яких реалізується спочатку при накопиченні радіонукліду в залишковій тканині та метастазах ДРЩЗ, а потім — під час виведення його з організму. Виявилося, що поглинена доза на критичні органи, в тому числі й на червоний кістковий мозок, після курсу РЙТ становить в середньому 0,5 Гр. При цьому багаторазове використання високих активностей ¹³¹I збільшує променеве навантаження на тканини організму (Гарбузов П.И. и соавт., 2007; Мельниченко Г.А. и соавт., 2008; Milas Z. et al., 2011; American Thyroid Association Taskforce On Radioiodine Safety, 2011).

Вважається, що тканини молодого організму більш чутливі до опромінення. З іншого боку, період напіввиведення ¹³¹I із периферичної крові прооперованих дітей та молодих дорослих із ДРЩЗ коротший за аналогічний показник у хворих старшого віку, що деякою мірою може зменшувати опромінення здорових тканин та клітин периферичної крові (Цыб А.Ф. и соавт., 2004).

Імунна система належить до найбільш чутливих до радіоактивного опромінення, особливо на рівні кістковомозкових попередників. До того ж вразливість клітин імунної системи підвищується з віком внаслідок зниження їхньої здатності відновлювати функції після дії опромінення (Аклеев А.В., 2007).

Важливу роль у боротьбі організму з пухлиною та ускладненнями хвороби відіграє стан вродженого імунітету — природних клітин-кілерів (natural killer (NK-)cells), макрофагів, поліморфноядерних нейтрофільних гранулоцитів (НФ) тощо. Разом з тим роль НФ в онкогенезі неоднозначна, оскільки завдяки імунорегуляторним властивостям вони можуть проявляти як протипухлинну, так і пропухлинну активність. Вважають, що на ранній стадії росту пухлини весь свій цитотоксичний потенціал — активні форми кисню (АФК), цитокіни, протеолітичні ферменти, білки гранул тощо — НФ спрямовують на протипухлинну активність, а на пізніх стадіях ці клітини сприяють мутагенезу, ангіогенезу, поширенню пухлини та прогресуванню хвороби (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005; Мальцева В.Н., Сафронова В.Г., 2009). Крім того, НФ теж перебувають під впливом малігнізованих клітин, що виробляють цитокіни, як у разі культури тиреоїдних клітин KHM-5M, отриманої з недиференційованого РЩЗ, яка активно продукує інтерлейкін-8 — активатор хемотаксичної активності НФ (Yoshida М. et al., 1992).

Відомо, що НФ периферичної крові здатні проявляти спонтанну і стимульовану цитотоксичну активність проти різних клітин-мішеней — трансформованих та нормальних (Cortens M. et al., 1980; Dallegri F. et al., 1984). Лізис клітин-мішеней НФ можуть здійснювати за допомогою кисеньзалежних механізмів з участю АФК (О^2-, *ОН, ОCl^– тощо) і кисеньнезалежних механізмів за допомогою дегрануляції білків (мієлопероксидази, серинових протеаз, дефензинів, перфорину, гранзиму В тощо). Як свідчать результати експериментальних дослідждень, розвиток імуногенної пухлини в організмі мишей супроводжується запальною реакцією, збільшенням кількості й розміру НФ в осередку запалення та збільшенням продукції АФК ізольованими НФ (Поцелуева М.М. и соавт., 2005). Тому визначення стану НФ за наявності онкологічної патології є актуальним і може мати прогностичне значення. Дослідження цитотоксичної активності НФ у хворих на ДРЩЗ різного віку після РЙТ залежно від наявності метастазів у літературі не представлено.

Мета дослідження — з’ясувати вплив РЙТ на цитотоксичну активність НФ периферичної крові хворих молодого віку із ДРЩЗ без віддалених метастазів у динаміці та порівняти з відповідним показником у хворих старшого віку.

Об’єкт і методи дослідження

Досліджували активність НФ у прооперованих хворих на ДРЩЗ без віддалених метастазів, які проходили РЙТ у ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка» НАМН України та Національному інституті раку. Пацієнтів за віком розподілили на дві групи. До 1-ї включено 26 пацієнтів молодого віку (5 (19%) чоловіків та 21 (81%) жінку), середній вік яких становив 28,6±1,1 року, усі з папілярною карциномою, розповсюдженням Т_I–Т_III. У 11 (42%) осіб були регіонарні метастази в лімфовузли шиї чи середостіння. До 2-ї групи ввійшли 33 хворих старшого віку (8 (24%) чоловіків та 25 (76%) жінок), середній вік — 52,6±1,5 року. Серед них фолікулярна карцинома була діагностована у 9 (27%) випадках, розповсюдження пухлини Т_I–Т_III мали 24 (73%) хворих, Т_IV — 9 (27%) осіб, 14 (42%) пацієнтів мали регіонарні метастази. Більшість пацієнтів обох груп отримали 1–2 курси РЙТ. Дослідження проводили напередодні прийому Na¹³¹I та через 6 діб; 1; 3 та 6 міс після РЙТ (3815–4170 МБк). Дві контрольні групи складалися з донорів відповідного віку і статі.

Виділення НФ із периферичної крові проводили у градієнті щільності Histopaque-1,119 г/мл («Sigma», США) після виділення лімфоцитів у градієнті щільності Histopaque-1,077 г/мл та від­окремлення еритроцитарної маси за допомогою 10% розчину желатину («Генезис», Україна). Для дослідження функції НФ, окрім спонтанної, визначали індуковану цитотоксичну активність НФ після інкубації з ліпополісахаридом (ЛПС) E. coli O111:B4 («Difco», СШA) або конканаваліном-А (Кон-А) («Sigma», США). Спонтанну активність НФ визначали за методом F. Dallegri та співавторів (1984) у нашій модифікації (Захарченко Т.Ф., 2009). Мітоген-індуковану цитотоксичність НФ визначали за модифікованим методом M Cortens та співавторів (1980). Оцінка цитотоксичної активності НФ базується на спектрофотометричному визначенні кількості гемоглобіну, який вивільнився зі зруйнованих ефекторами клітин-мішеней (мишачі еритроцити) у процесі їх поєднаної інкубації. Активність НФ визначали за індексом цитотоксчиності.

Cтатистичне опрацювання одержаних даних проводили з використанням комп’ютерних програм Microsoft Excel, BioStat та критерію Стьюдента (t). Результати оцінювали за рівнем значущості (p).

Результати та їх обговорення

Результати дослідження активності НФ у донорів та прооперованих хворих молодого віку (1-ша група) без віддалених метастазів ДРЩЗ напередодні та у різні строки після курсу РЙТ наведено в табл. 1. Виявлено, що у донорів активність НФ, індукованих ЛПС, достовірно вища в 1,4 раза, а індукованих Кон-А — вища в 1,5 раза, ніж активність НФ без стимуляції, що свідчить про високу здатність цих гранулоцитів відповідати на мітогени, а також про їхній високий резервний потенціал.

Дослідження спонтанної цитотоксичної активності НФ у хворих молодого віку без віддалених метастазів показало, що у групі до проведення РЙТ активність цих клітин відносно донорів знижена (27,6±1,6% проти 33,0±1,2%). Дослідження індукованої цитотоксичної активності НФ виявило, що у цих хворих після інкубації з ЛПС активність НФ також достовірно знижена (37,6±2,1% проти 44,8±1,8%), після інкубації з Кон-А — знижена, але ця різниця не сягає рівня статистичної значущості.

Результати дослідження динаміки активності НФ у хворих на ДРЩЗ молодого віку без віддалених метастазів у різні терміни після проведення РЙТ свідчать про хвилеподібний характер змін показника. Так, через 6 діб після РЙТ спонтанна активність корелює з індукованою активністю НФ порівняно з вихідним значенням. При цьому спонтанна активність НФ підвищується в 1,35 раза (37,2±1,7% проти 27,6±1,6%), індукована ЛПС — підвищується в 1,4 раза (51,5±2,3% проти 37,6±2,1%), індукована Кон-А — має тенденцію до підвищення. Через 1 міс після проведення РЙТ спонтанна та індукована активність НФ у хворих молодого віку не зазнає істотних змін порівняно з вихідними значеннями та недостовірно відрізняється від відповідних показників у донорів. Через 3 міс після РЙТ активність НФ у цих хворих знову підвищується порівняно з вихідним значенням: спонтанна — в 1,25 раза, індукована ЛПС — в 1,2 раза. Через 6 міс після РЙТ спонтанна та індукована ЛПС активність НФ знижується в 1,5 раза, індукована Кон-А — в 1,4 раза порівняно з вихідним значенням. Все це свідчить про порушення функції НФ під впливом РЙТ, яке триває протягом 6 міс.

При зіставленні показника індукованої активності НФ в усіх групах після РЙТ із відповідним показником спонтанної активності цих клітин виявлено достовірне підвищення індукованої активності НФ, що свідчить про здатність НФ відповідати на стимуляцію мітогенами в умовах РЙТ, а також про збереження резервного потенціалу цих лейкоцитів.

Результати дослідження цитотоксичної активності НФ у хворих без віддалених метастазів ДРЩЗ молодого віку (1-ша група) порівняно зі старшими хворими (2-га група) наведено в табл. 2. Спонтанна цитотоксична активність НФ у молодих донорів порівняно зі старшими донорами змінюється недостовірно, що свідчить про відсутність істотної вікової залежності щодо цього показника у здорових осіб. У різні періоди після РЙТ функція НФ у хворих різного віку має істотну відмінність. Так, у 2-й групі спонтанна активність НФ після РЙТ знижена протягом 6 міс, у 1-й групі цей показник достовірно підвищений у дуже ранній термін (6 діб) та через 3 міс після РЙТ, нормалізується через 1 міс та знижується через 6 міс після проведення РЙТ.

При порівнянні спонтанної цитотоксичної активності НФ у хворих до проведення РЙТ та у різні строки після РЙТ залежно від віку було відзначено, що активність НФ у молодих (середній вік — 28,6±1,1 року) пацієнтів вища, ніж у хворих старшого віку (середній вік — 52,6±1,5 року). Відмінність показників у цих групах, очевидно, від­ображає особливості імунологічного стану, стадії онкологічного захворювання, наявність метастазів, впливу РЙТ, а також різний функціональний резерв НФ та різну здатність до відновлення.

За даними літератури, порівняння абсолютної кількості НФ у здорових донорів різного віку показало значне зниження цього показника лише у старечому віці (≥85 років). З віком порушується продукція АФК у відповідь на N-форміл-пептид, фагоцитарна і перетравлювальна здатність НФ, але міграція та адгезія НФ не відрізняються від показників в осіб молодого віку (Polignano A. et al., 1994).

Виявлене нами пригнічення активності НФ у хворих на ДРЩЗ молодого віку ще до отримання РЙТ може бути зумовлене гіпотиреозом пацієнтів, на фоні якого проводили РЙТ, оскільки тиреоїдні гормони можуть впливати на функцію НФ. Отримані дані узгоджуються з нашими попередніми результатами у хворих на ДРЩЗ старшого віку, в яких також було відзначено зниження цитотоксичної активності НФ ще до РЙТ (Захарченко Т.Ф. и соавт., 2011).

Показане підвищення активності НФ через 3 міс після РЙТ може відображати опосередкований вплив на ці клітини тирео­їдних гормонів. З джерел літератури відомо, що у хворих на РЩЗ призначення тиреотропний гормон (ТТГ)-супресивної терапії L-тироксином після РЙТ призводить до підвищення продукції АФК та рівня внутрішньоклітинного вільного Са²⁺ НФ крові у відповідь на хемотаксичний препарат N-форміл-пептид (Marino F. et al., 2006). Підвищення активності НФ також відзначено під час дослідження функції цих клітин у людей, опромінених малими дозами радіації під час аварії на ЧАЕС, в якому показано стимуляцію окисної здатності НФ (Коляда Т.И. и соавт., 2007). З іншого боку, зниження активності НФ може бути зумовлене зниженням активності ферментів гранул цих лейкоцитів — лужної фосфатази та мієлопероксидази — під дією низької дози опромінення, що було продемонстровано in vitro (Тимошевский А.А. и соавт., 2001) а також у медичних працівників, які контактують із радіонуклідами і які з діагностичною метою приймали ¹³¹I або ^{99 m}Tc (Milacic S., 2009). Це свідчить про неоднозначну реакцію НФ на низькодозове випромінювання.

Отже, виявлено істотніше зниження активності НФ після РЙТ у хворих на ДРЩЗ без віддалених метастазів старшого віку порівняно з дорослими хворими молодшого віку. Це свідчить про більш виражену недостатність у хворих старшого віку ефекторної (захисної) функції НФ у боротьбі з раком, супроводжувальною інфекцією, запаленням та можливими ускладненнями. Порушення активності НФ під впливом РЙТ підтверджує необхідність розробки методів імунокорекції, можливість і доцільність їх застосування у комплексному лікуванні та реабілітації хворих на ДРЩЗ з метою покращання якості їхнього життя.

Висновки

У хворих на ДРЩЗ без віддалених метастазів цитотоксична активність НФ до курсу РЙТ достовірно нижча, ніж у донорів, незалежно від віку.

Дослідження динаміки спонтанної та міо­ген-індукованої цитотоксичної активності НФ (6 діб; 1; 3 та 6 міс) після РЙТ у хворих на ДРЩЗ без віддалених метастазів різних вікових груп виявило істотну відмінність. У осіб молодшого віку динаміка активності НФ має хвилеподібний характер. Через 6 діб і 3 міс після РЙТ спонтанна та індукована ЛПС активність НФ підвищуються порівняно з вихідним значенням, а через 6 міс ці показники знижуються у ≥1,4 раза. На відміну від цього, у хворих старшого віку спонтанна цитотоксична активність НФ знижена протягом усіх 6 міс після РЙТ.

Нижча цитотоксична активність НФ у хворих на ДРЩЗ без віддалених метастазів старшого віку до та в усі строки після РЙТ свідчить про меншу здатність цих ефекторів вродженого імунітету протидіяти раку та вищу ймовірність виникнення у хворих старшого віку ускладнень і можливої пролонгації хвороби.

Список використаної літератури

• Аклеев А.В. (2007) Реакции тканей на хроническое воздействие ионизирующего излучения. Радиац. биология. Радиоэкология, 49(1): 5–20.
• Бережная Н.М., Чехун В.Ф. (2005) Иммунология злокачественного роста. Наукова думка, Київ, 792 с.
• Берштейн Л.М. (2007) Рак щитовидной железы: эпидемиология, эндокринология, факторы и механизмы канцерогенеза. Практич. онкология, 8(1): 1–8.
• Гарбузов П.И., Дроздовский Б.Я., Родичев А.А. и др. (2007) Радиойодтерапия рака щитовидной железы. Практич. онкология, 8(1): 42–45.
• Захарченко Т.Ф. (2009) Визначення цитотоксичної активності нейтрофілів у хворих на рак щитовидної залози з віддаленими метастазами після радіойодтерапії. Лаб. діагностика, 4: 31–35.
• Захарченко Т.Ф., Замотаева Г.А., Тронько Н.Д. (2011) Функциональные показатели эффекторов врожденного иммунитета у больных с отдаленными метастазами рака щитовидной железы после радиойодтерапии. Мед.-биол. проблемы жизнедеятельности, 1(5): 88–92.
• Коляда Т.И., Брусник С.Б., Андреева И.Д. и др. (2007) Некоторые особенности иммунного ответа под влиянием различных доз ионизирующего облучения у животных и человека. Ann.Mechnicov Institute, 3: 17–22.
• Мальцева В.Н., Сафронова В.Г. (2009) Неоднозначность роли нейтрофила в генезе опухоли. Цитология, 51(6): 467–474.
• Мельниченко Г.А., Трошина Е.А., Ванушко В.Э. и др. (2008) Спорные вопросы лечения дифференцированного рака щитовидной железы. Проблемы эндокринологии, 54(2): 14–21.
• Поцелуева М.М., Пустовидко А.В., Ковалева Е.В. и др. (2005) Цитотоксическое действие полиморфноядерных лейкоцитов на опухолевые и нормальные клетки in vitro и in vivo. Цитология, 47(1): 57–63.
• Процик В.С., Остапенко О.М., Трембач О.М., Тимошенко А.В. (2000) Значення прогностичних факторів при лікуванні хворих на рак щитовидної залози. Онкологія, 2(3): 153–156.
• Тимошевский А.А., Гребенюк А.Н., Калинина Н.М. (2001) Реакция нейтрофилов периферической крови у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС на дополнительное радиационное воздействие in vitro. Мед. радиология и радиац. безопасность, 46(4): 28–32.
• Цыб А.Ф, Дроздовский Б.Я., Родичев А.А. (2004) Радиойодтерапия отдаленных метастазов рака щитовидной железы у детей и подростков. Мед. радиология и радиац. безопасность, 49(4): 36–44.
• American Thyroid Association Taskforce On Radioiodine Safety; Sisson J.C., Freitas J., McDougall I.R. et al. (2011) Radiation safety in the treatment of patients with thyroid diseases by radioiodine ¹³¹I: practice recommendations of the American Thyroid Association. Thyroid., 21(4): 335–346.
• Cortens M., Sklar S., Richter M. (1980) The detection and identification of subpopulations of circulating human lymphocytes, monocytes and neutrophils capable of effecting a mitogen-induced cell-mediated cytotoxic reaction towards erythrocytes of various species. Immunology, 41(3): 623–634.
• Dallegri F., Frumento G., Ballestrero A. et al. (1984) Naturally-occurring cellular cytotoxicity mediated by neutrophil polymorphonuclears: requirements for the target cell lysis. J. Clin. Lab. Immunol., 15(1): 35–37.
• Marino F., Guasti L., Cosentino M. et al. (2006) Thyroid hormone and thyrotropin regulate intracellular free calcium concentrations in human polymorphonuclear leukocytes: in vivo and in vitro studies. Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 19(1): 149–160.
• Milacic S. (2009) Granulocytes’ enzymes as biomarkers of radiotoxicity in individuals occupationally exposed to low-level radiation. J. BUON., 14(1): 85–91.
• Milas Z., Shin J., Milas M. (2011) New guidelines for the management of thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Minerva Endocrinol., 36(1): 53–70.
• Polignano A., Tortorella C., Venezia A. et al. (1994) Age-associated changes of neutrophil responsiveness in a human healthy elderly population. Cytobios., 80(322): 145–153.
• Yoshida M., Matsuzaki H., Sakata K. et al. (1992) Neutrophil chemotactic factors produced by a cell line from thyroid carcinoma. Cancer Res., 52(2): 464–469.

Адреса для листування:
Захарченко Тамара Федорівна
04114, Київ, вул. Вишгородська, 69
ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка» НАМН України