Полиморфизм T-786C промотора гена эндотелиальной NO-синтазы: связь с эффективностью тромболитической терапии у пациентов с острым инфарктом миокарда

ВВЕДЕНИЕ

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), в частности острый инфаркт миокарда (ОИМ), является объектом интенсивных генетических исследований. К исследуемым относится ген эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Этот фермент участвует в синтезе NO эндотелием и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса, кровотока и артериального давления. NO, возможно, имеет значение и в патогенезе ИБС, поскольку угнетает пролиферацию гладкомышечных клеток, а также обладает протекторным эффектом в отношении агрегации тромбоцитов и ингибирует адгезию лейкоцитов к эндотелию (Мoйбенко О.О. та співавт., 1997; Досенко В.Є. та співавт., 2002).

Подавление или снижение активности eNOS приводит к недостатку оксида азота — дисфункции эндотелия, которой согласно классической теории «ответ на повреждение» отводится основная роль в инициации атерогенеза, а также развитии атеротромбоза (Harrison D.G., 1997; Luscher T.F. et al., 1997; Mehta J.L., Li D.Y., 1999; Jeerooburkhan N. et al., 2001).

Ген, кодирующий eNOS, находится в хромосоме 7q35–36 и состоит из 26 экзонов (Marsden P.A. et al., 1993). Промотор гена eNOS содержит несколько доменов, то есть может регулироваться рядом факторов транскрипции (Zhang R. et al., 1995). На сегодня описан полиморфизм гена eNOS в 11 местах, 8 из которых изучали в качестве возможных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (Poirier O. et al., 1999; Wang X.L., Wang J., 2000; Hyndman M.E. et al., 2002). Наиболее изученными являются полиморфизм 4a/b 4-го интрона, полиморфизм G894T (Glu298Asp) 7-го экзона и полиморфизм Т-786С промотора гена eNOS (Alvarez R. et al., 2001; Casas J.P. et al., 2004).

Наша работа посвящена изучению распространенности, патогенетического значения полиморфизма Т-786С промотора гена eNOS у больных с ОИМ в украинской популяции, а также взаимосвязи с эффективностью тромболитической терапии (ТЛТ). Нами не найдено данных литературы о результатах генетических исследований роли eNOS в эффективности фибринолитической терапии. Предпринятая нами попытка оценить такую взаимосвязь представляет интерес как с точки зрения углубления медико-генетических знаний данной патологии, так и инициирования новых исследований генетики ОИМ.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены 249 пациентов, поступивших в отделение реанимации и интенсивной терапии Национального научного центра «Институт кардиологии имени академика Н.Д. Стражеско» с диагнозом ОИМ. ТЛТ была проведена у 154 пациентов в возрасте 46–75 лет (в среднем — 56,4±0,5 года). Критерием включения в исследование было наличие типичного ангинозного болевого синдрома с изменениями ЭКГ (элевация сегмента ST ≥2 мм как минимум в 2 смежных отведениях), возраст 21 год и старше, госпитализация в течение 6 ч от начала развития симптомов ИМ, показания к фибринолитической терапии. ОИМ диагностировали на основании данных клинических, электрокардиографических и биохимических исследований согласно существующим рекомендациям (Bertrand M.E. et al., 2002). В исследование не включали больных с хронической сердечной недостаточностью (NYHA III–IV), истинным кардиогенным шоком, тяжелой формой сахарного диабета, неконтролируемой гипертензией, выраженной почечной (креатинин ≥265 ммоль/л) и печеночной недостаточностью, нарушениями в системе гемостаза. Также обследованы 83 практически здоровых донора, у которых отсутствие сердечно-сосудистой патологии подтверждали данные анамнеза, ЭКГ и измерение артериального давления.

Для анализа взаимосвязи эффективности ТЛТ с полиморфизмом гена eNOS из обследованных больных были ретроспективно выбраны 154 пациента, которым при поступлении в стационар проведена терапия стрептокиназой (СК) 1 500 000 ЕД. Всем больным проводили базисную терапию, при наличии показаний назначали диуретики, наркотические анальгетики, антиаритмические средства. При этом у 60 пациентов с ОИМ перед введением СК использовали внутривенную инфузию блокатора липоксигеназ и модулятора метаболизма оксида азота Корвитина (инфузионная форма кверцетина) по следующей схеме: в 1-е сутки Корвитин вводили путем внутривенной инфузии длительностью 15–20 мин при поступлении, через 2 и 12 ч в дозе 0,5 г 10% препарата, растворенного в 50 мл физиологического раствора NaCI. На 2-е и 3-и сутки Корвитин вводили дважды по 0,5 г с интервалом 12 ч, на 4-е и 5-е сутки — однократно в дозе 0,25 г. Эти больные составили 1-ю группу. В группу сравнения (контроля) вошли 94 пациента, у которых применяли стандартное лечение (табл. 1 и 2).

Таблица 1
Исходные клинико-анамнестические данные больных с ОИМ, включенных в исследование

Таблица 2
Медикаментозная терапия больных с ОИМ, включенных в исследование

Для оценки эффективности реперфузионной терапии использовали неинвазивные маркеры: серийное определение активности изофермента креатинфосфокиназы МБ-КФК в периферической венозной крови в течение 3 сут заболевания, критерием эффективности считалось достижение пика МБ-КФК в течение 10 ч от начала ТЛТ (Смирнов А.А. и соавт., 1987), и оценку эффективности тканевой реперфузии по разрешению элевации сегмента ST на электрокардиограмме (Ribichini F. et al., 2004). Использовали анализ одного отведения с наибольшей исходной элевацией сегмента ST (Schroder K. et al., 2003). Критерием эффективности реперфузии при инфарктах нижней стенки левого желудочка служило снижение сегмента ST на ≥70% исходной величины, при инфарктах передней локализации — ≥50% (de Lemos J.A. et al., 2000). Указанные пороговые величины применяли для сравнения трех электрокардиограмм, снятых перед началом ТЛТ, на 60-й и 180-й минуте.

Генетические исследования были проведены в Институте физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины.

Статистический анализ результатов проводили с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2000 и статистической программы SPSS (версия 11, США). Достоверными считали различия при р<0,05. Данные представлены в виде М±м.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное генотипирование полиморфизма Т-786С промотора гена eNOS у 249 больных с ОИМ выявило следующее соотношение нормальных гомозигот, гетерозигот и патологических гомозигот — 47,8; 36,9 и 15,3%. В группе 83 здоровых добровольцев это соотношение составляло соответственно 48,2; 45,8 и 6,0% (рис. 1). Наблюдаемое распределение частоты выявляемости генотипов промотора в группе обследованных больных и группе здоровых доноров соответствовало равновесию Харди — Вейнберга.

Рис. 1. Полиморфизм Т-786С промотора гена eNOS у больных с ОИМ и здоровых доноров

Таким образом, у больных c ОИМ примерно в 2,5 раза чаще, чем у здоровых доноров, выявляли гомозиготы с патологическим генотипом СС промотора гена eNOS (соответственно 15,3 и 6,0%; p=0,05). Полученные данные позволяют предположить патогенетическое значение данного полиморфизма в развитии ОИМ в украинской популяции (Досенко В.Е. и соавт., 2005). В эксперименте установлено, что наличие аллеля С в положении 786 промотора гена eNOS приводит к снижению его активности на 52%, а формирующийся в результате этого недостаток eNOS является причиной снижения синтеза и высвобождения оксида азота и дисфункции эндотелия (Yoon Y. et al., 2000; Tanus-Santos J.E. et al., 2002; Rossi G.P. et al., 2003; Song J. et al., 2003). У людей с патологическим генотипом промотора гена eNOS (СС и ТС) отмечают увеличение тонуса венечных артерий, повышенную склонность к коронароспазму и извращенной реакции венечных артерий на введение ацетилхолина, что может служить основой для развития ИБС и острого коронарного синдрома (ОКС) (Motoyama T. et al., 1997; Yoshimura M. et al., 2000).

В европейской популяции выявляемость вариантов ТТ, ТС, СС промотора в положении 786 варьирует в значительных пределах — 29,9–40,6; 41,3–52,3 и 13,5–17,8% соответственно. При этом риск развития ИБС достоверно выше при гомозиготах СС, чем при гомозиготах ТТ (odds ratio (OR)=2,5 (1,3–4,8); р<0,01), причем генотип СС является независимым фактором риска развития коронарного атеросклероза. Также показано, что сам факт наличия патологического аллеля С является фактором риска развития ИБС (OR=1,7 (1,1–2,8); р=0,02 при сравнении с генотипом ТТ), а среди лиц с ИБС носители патологического аллеля имели более выраженное атеросклеротическое повреждение венечных артерий по данным коронароангиографии (Ghilardi G. et al., 2002; Colombo M.G. et al., 2003).

Выявляемость аллеля С в японской популяции, по данным исследования Suita, достаточно низкая (20,2% населения), а патологических гомозигот (СС) — около 1% всего населения. У больных с ИМ распространенность различных вариантов промотора не отличалась от таковой в общей популяции, что позволило сделать вывод об отсутствии роли этого полиморфизма в патогенезе ОИМ у японцев (Takagi S. et al., 2001). Вместе с тем в исследованиях M. Nakayama и соавторов (2000) мутация Т-786С ассоциировалась с коронарным спазмом и чаще выявлялась у больных с ИМ, особенно без органического стеноза венечных артерий по данным ангиографии (Nakayama M. et al., 2000).

Таким образом, патологический генотип СС промотора гена еNOS отмечают у 6,0% здоровых доноров в Украине, что достоверно больше, чем в японской популяции, и меньше, чем у западных европейцев.

Распространенность данного генотипа у больных с ОИМ в нашем исследовании была достоверно выше, чем у здоровых доноров, что указывает на роль полиморфизма Т-786С гена eNOS в патогенезе ОКС со стойкой элевацией сегмента ST на ЭКГ и совпадает с данными ряда исследований в других этнических группах (Colombo M.G. et al., 2003).

Из 249 больных с ОИМ ТЛТ проведена у 154 пациентов. Основная цель данной работы — изучение возможной взаимосвязи эффективности ТЛТ в зависимости от генотипа промотора гена еNOS. Соотношение ТТ, ТС и СС составило соответственно 43,5, 43,5 и 13,0%, что статистически не отличалось от основной группы пациентов с ОИМ.

Частота эффективной ТЛТ по данным неинвазивных маркеров реперфузии составила 51,1% в контрольной группе и 68,3% у пациентов, у которых дополнительно применяли внутривенную форму ингибитора 5-липоксигеназы кверцетина — Корвитин (р<0,05).

Далее нами проанализирована частота развития реперфузии коронарных артерий у больных, которым проводили ТЛТ (рис. 2). Ввиду небольшой выборки больных с ТС- и СС-генотипом объединили в одну группу.

Рис. 2. Частота успешной реперфузии при проведении ТЛТ у больных с ОИМ по данным неинвазивных маркеров

Результаты исследования свидетельствуют, что Корвитин достоверно повышает частоту восстановления коронарного кровотока, причем главным образом это достигается за счет больных с нормальным ТТ-генотипом промотора гена eNOS. Данный факт представляет интерес в связи с рядом аспектов. Так, нами впервые показана возможность улучшения результатов ТЛТ не путем применения нового антитромботического средства, а метаболически активного агента, достаточно безопасного в плане отсутствия риска развития кровотечений. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что для повышения эффективности реперфузионной терапии большое значение имеет биодоступность оксида азота — именно у больных с нормальной гомозиготой ТТ (то есть с сохраненной возможностью увеличения синтеза оксида азота) путем применения Корвитина удается улучшить результаты лечения. У больных же с гетерозиготой ТС и патологической гомозиготой СС отмечают исходные нарушения синтеза фермента и исходный недостаток образования оксида азота. При таких условиях Корвитин не смог реализовать своего потенциала. Эти результаты служат подтверждением того, что механизмом позитивного действия Корвитина при ТЛТ у больных с ОИМ является его способность влиять на метаболизм оксида азота.

Полученные данные могут служить обоснованием к разработке нового подхода лечения больных с ОИМ, подвергшихся реваскуляризации миокарда, с целью улучшения восстановления тканевого кровотока.

ВЫВОДЫ

1. Патологический генотип СС промотора гена eNOS у больных с ОИМ выявляется достоверно чаще, чем в здоровой популяции жителей Украины того же возраста.

2. Применение внутривенной формы ингибитора 5-липоксигеназы кверцетина — препарата Корвитин — у больных с ОИМ и ТТ-генотипом промотера гена еNOS Т-786С способствует повышению частоты успешной реперфузии при проведении ТЛТ.

3. Положительный эффект Корвитина при проведении ТЛТ реализуется, по-видимому, вследствие его способности улучшать биодоступность оксида азота у больных с нормальными функциональными способностями eNOS (при наличии ТТ-генотипа промотера синтазы).

4. Авторами предлагается дальнейшая проверка гипотезы улучшения результатов ТЛТ и других видов терапии синдрома ишемии-реперфузии путем влияния на активность eNOS и метаболизм оксида азота.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы выражают признательность Научно-производственному центру «Борщаговский химико-фармацевтический завод» за предоставленный для исследования препарат Корвитин.

Ссылки

• 1. Досенко В.Е., Лутай Я.М., Загорий В.Ю. и др. (2005) Частота аллельного полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы у больных с острым коронарным синдромом в украинской популяции. Цитол. и ген., 39(2): 49–54.
• 2. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко О.О., Пархомен¬ко О.М. (2002) Патофізіологічні аспекти генетичного полімор¬фізму ендотеліальної NO-синтази. Фізіол. журн., 48(6): 86–102.
• 3. Мoйбенко О.О., Сагач В.Ф., Шаповал Л.М. та ін. (1997) Роль ендотелію та біологічно-активних речовин ендотеліаль¬ного походження в регуляції кровообігу та діяльності серця. Фізіол. журн., 43(1–2): 3–18.
• 4. Смирнов А.А., Дорогун Б.Н., Померанцев Е.В. и др. (1987) Особенности гемодинамики, некоторых электрокардиогра¬фических и биохимических показателей у больных с инфарктом миокарда при тромболитической терапии. Тер. архив, 10: 17–21.
• 5. Alvarez R., Gonzalez P., Batalla A. et al. (2001) Association between the NOS3 (-786 T/C) and the ACE (I/D) DNA genotypes and earlycoronaryarterydisease. Nitric Oxide, 5(4): 343–348.
• 6. Bertrand M.E., Simoons M.L., Fox K.A. et al.; Task Force on the Management of Acute Coronary Syndromes of the European Society of Cardiology (2002) Management of acute coronarysyn¬dromes in patients presenting without persistent ST-segment eleva¬tion. Eur. Heart J., 23(23): 1809–1840.
• 7. Casas J.P., Bautista L.E., Humphries S.E., Hingorani A.D. (2004) Endothelial nitric oxide synthase genotype and ischemic heart disease: meta-analysis of 26 studies involving 23028 subjects. Circulation, 109(11): 1359–1365.
• 8. Colombo M.G., Paradossi U., Andreassi M.G. et al. (2003) Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of coronaryarterydisease. Clin. Chem., 49(3): 389–395.
• 9. de Lemos J.A., Antman E.M., Giugliano R.P. et al.; Throm¬bolysis in Myocardial Infarction (TIMI) 14 investigators (2000) ST-segment resolution and infarct-related arterypatencyand flow after thrombolytic therapy. Am. J. Cardiol., 85(3): 299–304.
• 10. Ghilardi G., Biondi M.L., DeMonti M. et al. (2002) Indepen¬dent risk factor for moderate to severe internal carotid arterysteno¬sis: T786C mutation of endothelial nitric oxide synthase gene. Clin. Chem., 48(7): 989–993.
• 11. Harrison D.G. (1997) Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. J. Clin. Invest., 100(9): 2153–2157.
• 12. Hyndman M.E., Parsons H.G., Verma S. et al. (2002) The T-786C mutation in endothelial nitric oxide synthase is associated with hypertension. Hypertension, 39(4): 919–922.
• 13. Jeerooburkhan N., Jones L.C., Bujac S. et al. (2001) Genetic and environmental determinants of plasma nitrogen oxides and risk of ischemic heart disease. Hypertension, 38(5): 1054–1061.
• 14. Luscher T.F., Tschudi M.R., Wenzel R.R., Noll G. (1997) Endothelial dysfunction and nitrogen monoxide (NO; nitric oxide). Internist (Berl.), 38(5): 411–419.
• 15. Marsden P.A., Heng H.H., Scherer S.W. et al. (1993) Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene. J. Biol. Chem., 268(23): 17478–17488.
• 16. Mehta J.L., Li D.Y. (1999) Inflammation in ischemic heart disease: response to tissue injuryor a pathogenetic villain? Cardio¬vasc. Res., 43(2): 291–299.
• 17. Motoyama T., Kawano H., Kugiyama K. et al. (1997) Endothelium-dependent vasodilation in the brachial arteryis impaired in smokers: effect of vitamin C. Am. J. Physiol., 273(4 Pt 2): H1644–1650.
• 18. Nakayama M., Yasue H., Yoshimura M. et al. (2000) T(-786)C mutation in the 5’-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with myocardial infarction, especiallywithout coronaryorganic stenosis. Am. J. Cardiol., 86(6): 628–634.
• 19. Poirier O., Mao C., Mallet C. et al. (1999) Polymorphisms of the endothelial nitric oxide synthase gene – no consistent associa¬tion with myocardial infarction in the ECTIM study. Eur. J. Clin. Invest., 29(4): 284–290.
• 20. Ribichini F., Ferrero V., Wijns W. (2004) Reperfusion treatment of ST-elevation acute myocardial infarction. Prog. Cardiovasc. Dis., 47(2): 131–157.
• 21. Rossi G.P., Taddei S., Virdis A. et al. (2003) The T-786C and Glu298Asp polymorphisms of the endothelial nitric oxide gene affect the forearm blood flow responses of Caucasian hypertensive patients. J. Am. Coll. Cardiol., 41(6): 938–945.
• 22. Schroder K., Wegscheider K., Zeimer U., Schroder R. (2003) Predic¬tion of long-term outcome bythe extent of existing ST-segment deviation in a single electrocardiographic lead shortlyafter thrombolysis in acute myocardial infarction. Am. J. Cardiol., 91(4): 454–457.
• 23. Song J., Yoon Y., Park K.U. et al. (2003) Genotype-specific influence on nitric oxide synthase gene expression, protein concen¬trations, and enzyme activityin cultured human endothelial cells. Clin. Chem., 49(6 Pt 1): 847–852.
• 24. Takagi S., Goto Y., Nonogi H. et al. (2001) Genetic polymor¬phisms of angiotensin converting enzyme (I/D) and endothelial nitric oxide synthase (T(-788)C) genes in Japanese patients with myocardial infarction. Thromb. Haemost., 86(5): 1339–1340.
• 25. Tanus-Santos J.E., Desai M., Deak L.R. et al. (2002) Effects of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms on plate¬let function, nitric oxide release, and interactions with estradiol. Pharmacogenetics, 12(5): 407–413.
• 26. Wang X.L., Wang J. (2000) Endothelial nitric oxide synthase gene sequence variations and vascular disease. Molec. Genet. and Metabol., 70(4): 241–251.
• 27. Yoon Y., Song J., Hong S.H., Kim J.Q. (2000) Plasma nitric oxide concentrations and nitric oxide synthase gene polymorphisms in coronaryarterydisease. Clin. Chem., 46(10): 1626–1630.
• 28. Yoshimura M., Nakayama M., Shimasaki Y. et al. (2000) A T-786C mutation in the 5’-flanking region of the endothelial nitric oxide synthase gene and coronaryarterial vasomotility. Am. J. Cardiol., 85(6): 710–714.
• 29. Zhang R., Min W., Sessa W.C. (1995) Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Sp1 and GATA factors are necessaryfor basal transcription in endothelial cells. J. Biol. Chem., 270(25): 15320–15326.