Цитокінпродукуюча властивість мононуклеарних клітин та рівень ендотеліну в плазмі крові у хворих на стабільну стенокардію напруження

Вступ

Атеросклероз — патологічний процес, що лежить в основі розвитку ішемічної хвороби серця (ІХС) і є головною причиною смерті та інвалідизації населення індустріальних країн. Патогенез атеросклерозу значною мірою зумовлений запальним компонентом, наявним вже на етапі виникнення первинних змін у стінці судини (Климов А.Н., 1986; Дзяк Г.В., Коваль Е.А., 1998). Початковий етап місцевого запалення — взаємодія моноцитів з ендотелієм. Це приводить до активації обох типів клітин, експресії ними прозапальних цитокінів, що стимулює міграцію лейкоцитів у субендотеліальний простір. Протягом останніх двох десятиліть активно вивчається роль ендотелію в патогенезі атеросклерозу. Ендотелій є активним ендокринним та паракринним органом, наявним у всіх судинних басейнах. Він відіграє значну роль у регуляції тонусу судин, перфузії міокарда та інших органів. Здоровий неушкоджений ендотелій унеможливлює тромбоутворення на своїй поверхні. На поверхні ендотеліоцитів містяться рецептори для взаємодії з імунокомпетентними клітинами.

Порушення функції ендотелію можна розглядати як ініціацію атеросклеротичного процесу. Одним із маркерів ушкодження ендотелію може служити рівень ендотеліну (ЕТ)-1 у плазмі крові. Підвищення його концентрації приводить до розвитку вираженої вазоконстрикції, а згодом — до проліферації та міграції гладком’язових клітин, що є наступною ланкою атерогенезу. Вазоконстрикція відіграє важливу роль у патогенезі артеріальної гіпертензії. ЕТ-1 є потужним ендогенним судинозвужувальним пептидом, який не лише бере участь у регуляції тонусу судин, але й виявляє мітогенну активність (Yanagisawa M. et al., 1988). Раніше був продемонстрований тісний кореляційний зв’язок між концентрацією ЕТ-1 у плазмі крові та швидкістю розвитку атеросклеротичного процесу (Lerman A. et al., 1991). Концентрація ЕТ-1 в плазмі крові підвищена у пацієнтів з гіперхолестеринемією (Dashwood M.R. et al., 1991), нестабільною стенокардією та гострим інфарктом міокарда. Ймовірно, це свідчить, що ЕТ відіграє роль у дестабілізації атеросклеротичної бляшки, тобто в патогенезі гострих коронарних синдромів (Stewart D.J. et аl., 1991; Ray S.G. et аl., 1992; Tomoda H., 1993; Qiu S. et аl., 1993; Wieczorek I. et al., 1994).

Мета проведеного дослідження — визначити варіабельність рівнів ЕТ-1 та цитокінів у плазмі крові, а також по можливості — виявити взаємозв’язок між ними і клінічними проявами стабільної стенокардії напруження (ССН).

Об’єкт і методи дослідження

Обстежено 55 хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні в Національному науковому центрі «Інститут кардіології імені академіка М.Д. Стражеска» НАМН України. Критеріями включення до дослідження були наявність ССН і згода учасників. У кожного хворого був зібраний анамнез, проведене рутинне клініко-інструментальне обстеження. Діагноз ІХС був встановлений на підставі анамнезу і клініко-інструментальних даних: коронаровентрикулографії (КВГ), велоергометрії (ВЕМ). ВЕМ проводили за стандартною методикою — зі східчастим підвищенням потужності на 25 Вт кожні 3 хв. Критеріями припинення тесту з дозованим фізичним навантаженням (ДФН) служили розвиток ангінозного нападу та/чи депресії сегмента ST за ішемічним типом. Навантажувальні проби проводили перед сніданком.

КВГ виконували за стандартною методикою — за Judkins. Пацієнти із ІХС були розподілені на дві групи: з помірними клінічними проявами — ССН І–ІІ функціонального класу (ФК) — 28 хворих (1-ша група) та з вираженими проявами — ССН ІІІ–ІV ФК — 27 пацієнтів (2-га група). До контроль­ної групи були включені 11 практично здорових людей — донорів. Середній вік пацієнтів із ІХС становив 57±4,1 року, донорів — 46,2±3,01 року (р<0,05).

Рівень цитокінів у середовищі культивації мононуклеарних клітин (МНК) визначали методом імуноферментного аналізу. Для визначення фактора некрозу пухлини (ФНП)-α та інтерлейкіну (ІЛ)-6 використовували імуноферментні тест-системи «Протеїновий контур» (Росія). Для визначення ІЛ-8, ІЛ-10 та γ-інтерферону (γ-ІФ) — «Amersham Pharmacia Biotech» (Англія). Виділення МНК проводили за методом Bojum на градієнті щільності фіколу («Pharmacia») — верографіну, щільність 1,076 («Spofa») із гепаринізованої крові (25 ОД гепарину на 1 мл крові з ліктьової вени). Для одержання супернатантів МНК розводили в середовищі 199 у концентрації 1,5 · 10⁶/мл, засівали в 24-лункові плоскодонні планшети по 1,0 мл у лунку і культивували у термостаті при 37 ˚С протягом 18 год без мітогену. Після цього надосадову рідину збирали у пробірки типу «Еппендорф» і зберігали при –20 ˚С до проведення дослідження.

Антитіла класу IgG до загального антигену хламідій/Chlamydia (Chl. trachomatis, Chl. psittaci, Chl. pneumoniae) визначали у сироватці крові за допомогою імуноферментного аналізу (тест-система Platelia Chlamydia IgG, Sanofi Diagnostics Pasteur, Франція), IgG до цитомегаловірусу (ЦМВ) — за допомогою імуноферментної тест-системи фірми «Human» (Німеччина).

Концентрацію ЕТ-1 визначали у плазмі крові з використанням імуноферментної тест-системи фірми «Amersham Pharmacia Biotech» (Англія) з попередньою екстрак­цією зразків у Amper-колонках відповідно до інструкції фірми-виробника.

Отримані результати лабораторних досліджень наведені у вигляді M±m із використанням критерію Стьюдента (t). Рівень статистичної значущості був прийнятий як p<0,05.

Результати та їх обговорення

Нами не виявлено істотних відмінностей у клінічних характеристиках (тютюнопаління, рівень холестерину, артеріальна гіпертензія) у хворих із різними ФК ССН. У всіх учасників 1-ї та 2-ї груп були позитивні тести з ДФН, у донорів — відповідно негативні. Одним із можливих етіологічних факторів ушкодження ендотелію вважаються деякі інфекційні агенти (Chl. pneumoniae; ЦМВ та інші вірусні агенти). Вони є індукторами запального процесу в судинній стінці, активаторами МНК та ендотеліоцитів (Melnick J.L. et al., 1995; Никитин Ю.П. и соавт., 2000), стимуляторами продукції прозапальних цитокінів та молекул адгезії (таблиця).

Концентрація ЕТ-1 у плазмі крові у практично здорових осіб становила 6,5±0,29 пг/мл (в діапазоні від 4,4 до 7,87), у хворих на ССН — 10,2±0,51 (р<0,05). У пацієнтів 1-ї групи — 9,2±0,25 пг/мл (в діапазоні від 8,3 до 10,8) (p<0,01 відносно групи контролю); 2-ї — 11,5±0,57 пг/мл (у діапазоні від 6,1 до 16) (p<0,001 відносно групи контролю). З наведених даних можна побачити, що концентрація ЕТ-1 у плазмі крові хворих 1-ї та 2-ї груп була вірогідно вищою порівняно з групою контролю і залежала від тяжкості стану пацієнтів.

У хворих на ССН виявлено суттєве підвищення здатності МНК до спонтанної продукції прозапальних цитокінів ІЛ-6, ІЛ-8 і ФНП-α (відповідно в 10,5; 1,8 і 12,3 раза порівняно з групою донорів). Вміст прозапальних цитокінів у плазмі крові тісно корелює зі ступенем ендотелійзалежної дилатації судин (Blann A.D., Lip G.Y., 1998).

В атеросклеротичному процесі ІЛ-6 відіграє роль прозапального та гепатоцитактивуючого фактора. Він синтезується моноцитами, макрофагами, лімфоцитами, фібробластами та клітинами ендотелію. Біологічні ефекти ІЛ-6 подібні до таких ІЛ-1 і ФНП-α (Biasucci L.M. et al., 1999) — це насамперед участь у реалізації імунної запальної реакції. ІЛ-6 більше, ніж два інші флогогенні цитокіни, впливає на синтез гепатоцитами білків гострої фази (С-реактивний білок, сироватковий амілоїд А, гаптоглобін, α₁– інгібітор протеїназ, фібриноген).

Детальний аналіз отриманих результатів у хворих 1-ї та 2-ї груп свідчить про статистично достовірне посилення продукції ІЛ-6 і ІЛ-8 (р<0,05). Водночас спостерігалася тенденція до зниження синтезу ФНП-α у 2-й групі пацієнтів. В основному ФНП-α продукується моноцитами/макрофагами, клітинами ендотелію та гладкими міоцитами. За спектром біологічних ефектів ФНП-α нагадує ІЛ-1 та ІЛ-6. Цитотоксична дія ФНП-α має комплексну природу. Показано, що ФНП-α сприяє посиленню продукції вільних радикалів, апоптозу ендотеліоцитів та інактивації оксиду азоту (NO) в ендотелії. ФНП-α порушує функцію ендотелію через такі механізми: зменшення експресії субодиниць NO-синтетази, підвищення продукції вільних радикалів (Berliner J.A. et al., 1995; Harrison D.G., 1997).

ФНП-α підсилює експресію молекул адгезії на поверхні ендотелію, активує макрофаги, нейтрофіли та зумовлює синтез білків гострої фази запалення. Високі концентрації ФНП-α частіше виявляються при гострих станах і тісно корелюють з активністю запалення. Зниження його продукції в хворих на ССН III–IV ФК ймовірно зумовлено активацією синтезу ІЛ-6 в супернатантах МНК, оскільки ІЛ-6 є єдиним із прозапальних цитокінів, що пригнічує продукцію ФНП-α.

Таким чином, у мережі взаємних впливів цитокінів всі ефекти є стимулюючими, і лише ІЛ-6 пригнічує синтез ФНП-α. Ця здатність ІЛ-6 визначає його подвійну роль у процесі запалення: за своєю природою він є типовим прозапальним цитокіном, але також виявляє протизапальну дію, пригнічуючи продукцію інших прозапальних цитокінів. Біологічний зміст цього зовні парадоксального явища ймовірно зводиться до того, що ІЛ-6 фактично завершує формування запального процесу. Підвищення рівня ІЛ-6 у хворих 2-ї групи відображає зростання проявів системного неспецифічного запалення при прогресуванні ІХС. Слід зазначити, що суттєве збільшення секреції ІЛ-6 монононуклеарами спостерігалося при нестабільній стенокардії та інфаркті міокарда.

Високий рівень ІЛ-8 свідчить про активацію не лише імунокомпетентних клітин (лімфоцитів і моноцитів), але й ендотеліоцитів. Це закономірно супроводжується підвищенням рівня ЕТ-1 у плазмі крові. Довготривала гіперсекреція прозапальних цитокінів (ІЛ-6 та ІЛ-8) може сприяти посиленню експресії адгезивних молекул, які потенціюють взаємодію лейкоцитів з ендотелієм і зумовлюють міграцію у вогнище запалення клітин крові (нейтрофілів, моноцитів, лімфоцитів, тромбоцитів). Міграція останніх сприяє запуску каскаду коагуляції на поверхні ендотелію.

Для вивчення можливої ролі інфекційних факторів у патогенезі атеросклеротичного процесу в учасників обстежених груп вивчено рівні специфічних антитіл. У 50 (90,9%) хворих на ССН виявлено високий рівень IgG до ЦМВ (123,7±5,6 од/мл; р<0,05) відносно групи донорів, серед яких лише 2 (18,2%) були серопозитивними (62,2±8,4 од/мл). Більш детальний аналіз дозволив установити, що ЦМВ-антитіла у хворих на ССН I–II ФК відзначаються у 25 (89,3%) випадків (титр — 118,5±9,1 од/мл, р<0,05), а в хворих на ССН III–IV ФК — у 26 (96,3%) (титр — 127,1±6,4 од/мл; р<0,05). Позитивна реакція на хламідії (антитіла класу IgG) виявлена у 27 (49,1%) пацієнтів із ССН, з них у 1-й групі — у 14 (50%) хворих, у 2-й групі — у 13(48,2%.) У групі здорових донорів хронічна хламідійна інфекція зареєстрована у 3 (27,3%) людей за рахунок сумнівних і слабопозитивних реакцій. Таким чином, виявлення високих титрів IgG до хламідій і ЦМВ та тісний взаємозв’язок між ними і факторами імунного запалення підтверджує участь інфекції в патогенезі атеросклерозу. Інфекційні агенти не є основною причиною розвитку атеросклерозу, вони діють на стадії неспецифічного імунного запалення, на відміну від традиційних факторів ризику (дисліпідемія, артеріальна гіпертензія, цукровий діабет, тютюнопаління, спадковість і т.д.), які запускають процес шляхом ушкодження ендотелію.

У пацієнтів зі ССН III–IV ФК виявлені прямі кореляційні зв’язки між рівнями антитіл до ЦМВ і ЕТ-1 (r=0,5; р<0,05), ФНП-α (r=0,9; р<0,05) та виражений зворотний кореляційний зв’язок між концентраціями у плазмі крові ЕТ-1 та γ-ІФ (r=–0,7; р<0,05). Також у цих хворих установлений взаємозв’язок між високим рівнем антитіл до хламідій і рівнем розчинних молекул адгезії (r=0,5; p<0,05) та ФНП-α (r=0,7; р<0,05).

У хворих на ССН I–II ФК установлений помірний зв’язок лише між високим рівнем антитіл до хламідій та рівнем ФНП-α (r=0,5; р<0,05), а також розчинних молекул адгезії (r=0,4; р<0,05), однак у цих пацієнтів відсутні кореляційні зв’язки між рівнями антитіл до ЦМВ і рівнями таких факторів імунного запалення, як ФНП-α і розчинні молекули адгезії.

Виявлене підвищення рівнів ІЛ-6, ІЛ-8 і ЕТ-1 при збільшенні ФК ССН, ймовірно, відображає їхній внесок у наростання дисфункції ендотелію у процесі прогресування ІХС.

Висновки

1. Тривала гіперсекреція прозапальних цитокінів (ІЛ-6 та ІЛ-8) МНК сприяє активації ендотеліоцитів. Це призводить до посилення експресії молекул адгезії, які здійснюють взаємодію лейкоцитів та ендотелію. Збільшення синтезу ІЛ-6 і ІЛ-8 у хворих на ССН є одним із ключових факторів погіршення функції ендотелію та прогресування ІХС.

2. Підвищення концентрації ЕТ-1 у плазмі крові у хворих на ССН тісно корелює з прогресією дисфункції ендотелію у процесі розвитку ІХС.

3. Низький рівень ФНП-α у супернатантах МНК хворих на ССН III–IV ФК зумовлений підвищенням рівня ІЛ-6, що пригнічує його синтез.

4. Виявлення високих титрів IgG до хламідій і ЦМВ та встановлений взаємозв’язок між ними і факторами імунного запалення, ймовірно, є доказом ролі інфекції в патогенезі атеросклерозу.

Література

• Дзяк Г.В., Коваль Е.А. (1998) Клинико-иммунологические критерии оценки прогноза и лечения атеросклероза и ревматизма. Журн. АМН України, 4(1): 78–87.
• Климов А.Н. (1986) Иммунореактивность и атеросклероз. Медицина, Ленинград, 192 с.
• Никитин Ю.П., Решетников О.В., Курилович С.А. и соавт. (2000) Ишемическая болезнь сердца, хламидийная и хеликобактерная инфекция (популяционное исследование). Кардиология, 8: 4–7.
• Berliner J.A., Navab M., Fogelman A.M. et al. (1995) Atherosclerosis: basic mechanisms. Oxidation, inflammation, and genetics. Circulation, 91(9): 2488–2496.
• Biasucci L.M., Liuzzo G., Fantuzzi G. et al. (1999) Increasing levels of interleukin (IL)-1Ra and IL-6 during the first 2 days of hospitalization in unstable angina are associated with increased risk of in-hospital coronary events. Circulation, 99(16): 2079–2084.
• Blann A.D., Lip G.Y. (1998) The endothelium in atherothrombotic disease: assessment of function, mechanisms and clinical implications. Blood Coagul. Fibrinolysis, 9(4): 297–306.
• Dashwood M.R., Sykes R.M., Muddle J.R. et al. (1991) Autoradiographic localization of [125I]endothelin binding sites in human blood vessels and coronary tissue: functional correlates. J. Cardiovasc. Pharmacol., 17(Suppl. 7): S458–S462.
• Harrison D.G. (1997) Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. J. Clin. Invest., 100(9): 2153–2157.
• Lerman A., Edwards B.S., Hallett J.W. et al. (1991) Circulating and tissue endothelin immunoreactivity in advanced atherosclerosis. N. Engl. J. Med., 325(14): 997–1001.
• Melnick J.L., Adam E., Debakey M.E. (1995) Cytomegalovirus and atherosclerosis. BioEssays, 17(10): 899–903.
• Qiu S., Théroux P., Marcil M., Solymoss B.C. (1993) Plasma endothelin-1 levels in stable and unstable angina. Cardiology, 82(1): 12–19.
• Ray S.G., McMurray J.J., Morton J.J., Dargie H.J. (1992) Circulating endothelin in acute ischaemic syndromes. Br. Heart. J., 67(5): 383–386.
• Stewart D.J., Kubac G., Costello K.B., Cernacek P. (1991) Increased plasma endothelin-1 in the early hours of acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol., 18(1): 38–43.
• Tomoda H. (1993) Plasma endothelin-1 in acute myocardial infarction with heart failure. Am. Heart. J., 125(3): 667–672.
• Wieczorek I., Haynes W.G., Webb D.J. et al. (1994) Raised plasma endothelin in unstable angina and non-Q wave myocardial infarction: relation to cardiovascular outcome. Br. Heart. J., 72(5): 436–441.
• Yanagisawa M., Kurihara H., Kimura S. et al. (1988) A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 332(6163): 411–415.

Адреса для листування:
Слободський Володимир Анатолійович
03151, Київ, вул. Народного ополчення, 5
Національний науковий центр
«Інститут кардіології імені академіка М.Д. Стражеска» НАМН України