Експресія М2-макрофагів, mTOR-позитивних клітин та VEGF у межах фіброепітеліальних поліпів шкіри у пацієнтів із метаболічним синдромом та цукровим діабетом 2-го типу

Вступ

Фіброепітеліальні поліпи (ФЕП) — найрозповсюдженіший варіант неоплазій шкіри, який часто може бути асоційований з ожирінням та цукровим діабетом (ЦД) 2-го типу (Молочков В., Хлебникова А., 2006; Tripathy T. et al., 2019). Найвища частота ФЕП шкіри характерна для осіб середнього та похилого віку, вагітних та людей з надмірною масою тіла (Горячкина М.В., Белоусова Т.А., 2014).

ЦД 2-го типу і метаболічний сидром (МС) супроводжуються розвитком мікроангіопатії, асоційованим з гіперпродукцією ендотеліального фактора росту судин (vascular endothelial growth factor — VEGF) (Shi G.J. et al., 2018). Феномен вираженої васкуляризації ФЕП у пацієнтів із МС та ЦД 2-го типу може бути пов’язаний із регуляцією ангіогенезу за участю VEGF та клітин-диригентів ремоделювання дерми, якими вважаються М2-макрофаги (Appari M. et al., 2018; Burhans M.S. et al., 2018).

mTOR (mammalian target of rapamycin) — серин/треонін протеїнкіназа, яка бере важливу участь у внутрішньоклітинному обміні речовин та регулює енергетичний стан. Порушення сигналізації mTOR може спричиняти розвиток ЦД 2-го типу або інсулінорезистентності (Mao Z., Zhang W., 2018).

У літературі відсутні дані щодо локальної експресії М2-макрофагів, mTOR-позитивних клітин та VEGF у межах ФЕП шкіри у пацієнтів із МС та ЦД 2-го типу.

Мета — вивчення експресії М2-макрофагів, mTOR-позитивних клітин та VEGF у межах ФЕП шкіри у пацієнтів із МС та ЦД 2-го типу порівняно з умовно здоровими особами.

Об’єкт і методи дослідження

У дослідження включено 102 пацієнти, які мали >3 рецидивуючих ФЕП шкіри. Групу контролю становили 62 умовно здорових волонтери. Діагноз ФЕП шкіри (папілома, папілома фіброепітеліальна, фібропапілома, м’яка фіброма, акрохордон) встановлювали відповідно до Міжнародної класифікації хвороб 10-го перегляду (D23.9).

Для імуногістохімічного дослідження (ІГХД) видалені ФЕП використовували в повному обсязі. ІГХД проведені у трьох групах. До 1-ї групи увійшли пацієнти без метаболічних порушень, до 2-ї — з верифікованим МС, 3-тя включала хворих на ЦД 2-го типу.

Гістологічні зрізи товщиною 4 мкм виготовляли на напівавтоматизованому ротаційному мікротомі «Thermo Scientific HM 340E». При мікроскопічному дослідженні матеріалу використовували мікроскоп «Nikon Eclipse E200» («Nikon Corporation», Японія).

ІГХД виконували у парафінових зрізах із використанням моноклональних антитіл. Після депарафінізації та регідратації зрізів проводили високотемпературне демаскування антигенів нагріванням на водяній бані у Трис-ЕДТА (рН 9,0) буфері, пригнічували активність ендогенної пероксидази 3% розчином перекису водню та наносили блокуючу сироватку. Інкубацію з первинними антитілами проводили відповідно до інструкцій фірм-виробників, візуалізацію імуногістохімічної реакції виконували з використанням системи детекції «DAKO EnVision™+ System» з діамінобензидином («DAKO», США). Зрізи дозабарвлювали гематоксиліном Майєра та поміщали в канадський бальзам.

У роботі проведено ІГХД з використанням моноклональних антитіл до CD163 (біомаркер М2-макрофагів) Cell Marque, клон MRQ-26, та проведено оцінку експресії регуляторних молекул, включаючи VEGF (DAKO, клон VG1) та елемент системи внутрішньоклітинної сигналізації mTOR (Abcam, клон EPR426(2)).

Наведені біомаркери використовували під час ІГХД, виконаного відповідно до стандартного протоколу та рекомендацій виробників антитіл для ІГХД, у патоморфологічній лабораторії «CSD Health Care».

При аналізі М2-макрофагів проводили оцінку абсолютної кількості імунопозитивних клітин у межах ФЕП на 1 мм². При цьому підрахунок кількості клітин проводили з урахуванням їх просторового розподілу. Враховуючи, що основною зоною ремоделювання шкіри при морфогенезі ФЕМ є ділянка епідермо-­дермальної взаємодії, підрахунок кількості гладких клітин проводили саме в цьому компартменті — у сосочковому шарі дерми та навколо судин поверхневого судинного сплетіння.

При оцінці експресії маркерів в епідермісі використовували шкалу вираженості експресії (TS) на основі оцінювання інтенсивності забарвлення та його розповсюдження. Інтенсивність імуногістохімічного забарвлення оцінювали напівкількісним методом як слабку (1+), помірну (2+) або виражену (3+).

Просторове розповсюдження експресії mTOR та VEGF в епідермісі оцінювали напівкількісним методом на основі визначення частки позитивних клітин таким чином: 0% позитивних клітин — негативно; 1–25% — 1+; 26–50% — 2+; 50% — 3+.

Загальну вираженість експресії mTOR та VEGF в епідермісі розраховували як інтенсивність, помножену на розповсюдженість експресії, і визначали як низьку (при кількості балів <6) або високу (>6). У межах дерми враховували інтенсивність імуногістохімічного забарвлення та кількість імунопозитивних клітин (чисельність розраховували на 1 мм²).

Дослідження виконували як випадок — контроль. Статистичне оброблення результатів проводили за допомогою програми «Minitab 16». Для перевірки розподілу на нормальність використовували тест Колмогорова — Смирнова, порівняння центральних тенденцій двох незалежних вибірок з використанням U-критерію Манна — Уїтні та порівняння середніх двох незалежних вибірок за критерієм Стьюдента. Кількісні змінні представлені у вигляді середніх значень (X) і середньоквадратичних відхилень (SD) або 95% довірчим інтервалом для параметричних методів, і медіани (Me) з 1 (Q1) і 3 (Q3) квартилем або 95% довірчим інтервалом для непараметричних.

Роботу виконували в рамках планових науково-дослідних тем кафедри дерматовенерології Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика. В усіх пацієнтів і волонтерів отримано добровільну письмову згоду на участь у науковому дослідженні.

Результати та їх обговорення

У ФЕП пацієнтів 1-ї групи експресія VEGF в епідермісі (рис. 1) була відсутня, в окремих випадках визначали слабку експресію в клітинах базального шару. Крім того, виражену експресію VEGF визначали в нечисленних клітинах дерми. Такі клітини були відрощатої форми і розташовувалися поблизу від судин. Більш численними VEGF-продукуючі клітини були у ділянках лімфогістіо­цитарної інфільтрації.

Рис. 1.

Експресія VEGF у ФЕП пацієнтів 1-ї групи. Незначну кількість VEGF визначали уздовж судин сосочкового шару дерми. Імуногістохімічне дослідження з використанням МАТ до VEGF

Збільшення у 200 разів.

У ФЕП пацієнтів 2-ї групи у більшості випадків визначали позитивну експресію VEGF в межах епідермісу — переважно в ме­жах базального та остистого шарів, більш виражену в ділянках акантозу. При цьому загальна інтенсивність експресії VEGF (враховуючи інтенсивність і розповсюдженість імуногістохімічної реакції) у пацієнтів із МС була статистично значуще вищою за показник у контролі (рис. 2). Ще більш виражені відмінності визначені щодо кількості VEGF-позитивних клітин у дермі (рис. 3).

Рис. 2.

Дифузійна експресія VEGF в епідермісі та численні помірно позитивні клітини в межах дерми ФЕП пацієнтів 2-ї групи. Імуногістохімічне дослідження з використанням МАТ до VEGF

Збільшення у 200 разів.

Рис. 3.

Вираженість експресії VEGF у межах епідермісу (а) та дерми (б) ФЕП пацієнтів різних груп

а — загальний рівень експресії VEGF в епідермісі, оцінений за інтенсивністю та розповсюдженістю експресії (TS). По осі абсцис — групи пацієнтів. По осі ординат — загальна оцінка експресії за TS (у.о.); б — кількість VEGF-позитивних клітин у дермі ФЕП. По осі ординат — абсолютна кількість клітин на 1 мм².

При аналізі експресії VEGF у пацієнтів 3-ї групи визначено слабку або помірну експресію VEGF у межах епідермісу. Причому позитивну реакцію визначали переважно в кератиноцитах базального шару — як і у 2-й групі, експресія була більш вираженою в ділянках акантозу. Загальний рівень експресії VEGF у пацієнтів 3-ї групи був статистично значуще вищим, ніж у хворих 1-ї групи, проте не відрізнявся статистично значуще від показника у 2-й групі. Як і в 2-й групі, у дермі визначали значну кількість помірно позитивних клітин, які переважали у ділянках інфільтрації вздовж кровоносних судин (рис. 4).

Рис. 4.

Слабка експресія VEGF в епідермісі та помірна — у клітинах дерми сосочкового шару дерми ФЕП пацієнтів 3-ї групи. ІГХД з використанням МАТ до VEGF

Збільшення у 200 разів.

Зазначимо, що на відміну від хворих 1-ї групи (де у клітинах дерми зареєстрована інтенсивність експресії VEGF на рівні 3+) у хворих 2-ї та 3-ї груп інтенсивність експресії у клітинах дерми була помірною чи слабкою, проте визначалася у значно більшій кількості клітин.

Окрім субепідермальної зони, значну кількість VEGF-позитивних клітин визначали в межах центральної частини ФЕП — у складі периваскулярних інфільтратів (рис. 5).

Рис. 5.

Численні помірно позитивні клітини в межах центральної частини ФЕП пацієнтів 3-ї групи. Імуногістохімічне забарвлення з використанням МАТ до VEGF

Збільшення у 200 разів.

Оскільки найпотужнішим джерелом продукції VEGF у дермі, окрім опасистих клітин, є М2-макрофаги, наступним кроком дослідження стала оцінка кількості та просторового розподілу цих клітин.

Дослідження кількості та просторової орієнтації М2-макрофагів у пацієнтів 1-ї групи показало наявність незначної чи помірної кількості CD163-позитивних клітин у межах ФЕП. У грибоподібних ФЕП М2-макрофаги були розташовані переважно навколо судин і значно менше під епідермісом. У ФЕП, що мали ниткоподібну форму у межах тонких виростів, М2-макрофаги виявлялися не тільки навколо судин, але й уздовж епідермо-­дермальної межі (рис. 6).

Рис. 6.

Особливості просторового розподілу та чисельності М2-макрофагів у межах ФЕП пацієнтів 1-ї групи. ІГХД з використанням МАТ до CD163

а — збільшення у 100; б — у 200 разів.

На відміну від цього, у хворих 2-ї групи визначено значно більшу кількість М2-макрофагів, які визначалися переважно в сосочковому шарі дерми ФЕП, і в меншій кількості — у межах цент­ральної частини ФЕП (рис. 7).

Рис. 7.

Значна кількість та особливості просторового розподілу М2-макофагів у межах ФЕП пацієнтів 2-ї групи. ІГХД з використанням МАТ до СD163

Збільшення у 50 разів.

Окрім скупчень СD163-позитивних клітин у межах периваскулярних інфільтратів навколо судин поверхневого судинного сплетіння, численних М2-макрофагів виявляли в межах вторинних сосочків дерми — безпосередньо на межі з епідермісом, а подекуди й у межах епідермісу. При достатньо високій щільності розміщення клітини утворювали сітку, що об’єднувала в єдину мережу клітини периваскулярного і суб­епідермального пулів (рис. 8).

Рис. 8.

Щільна сітка СD163-позитивних клітин у межах сосочкового шару дерми ФЕП. ІГХД з використанням МАТ до СD163

Збільшення у 100 разів.

Ще більш численними були М2-макрофаги у ФЕП пацієнтів 3-ї групи (рис. 9).

Рис. 9.

Кількість СD163 позитивних клітин у ФЕП пацієнтів різних груп

По осі абсцис — групи пацієнтів, по осі ординат — абсолютна кількість клітин на 1 мм².

Їх кількість в окремих поліпах була у 5–7 разів вища за показник у 1-й групі й статистично значуще перевищувала показник у 2-й групі (р=0,05). При цьому М2-макрофаги були численними не тільки в субепідермальній зоні, а й в центральних ділянках поліпів (рис. 10).

Рис. 10.

Численні М2-макрофаги у межах центральної та субепідермальної зон ФЕП пацієнтів 3-ї групи. ІГХД з використанням МАТ до СD163

Збільшення у 100 разів.

Інтерпретуючи отримані дані щодо М2-макрофагів, відзначимо, що раніше продемонстровано зв’язок між ожирінням та превалюванням М1-фенотипу макрофагів (Thomas D., Apovian C., 2017). Проте ці зміни описані для жирової тканини — переважно для вісцерального жиру, і пояснюють патогенез інсулінорезистентності за умов акумуляції вісцерального жиру та гіпертрофії адипоцитів. Відповідно до прозапальної концепції вісцеральне ожиріння асоційоване зі зростанням кількості М1-макрофагів, що є джерелом продукції численних прозапальних цитокінів та адипокінів, включаючи інтерлейкін-6 та фактор некрозу пухлини-α, які, окрім іншого, спроможні модулювати сенситивність інсулінових рецепторів (Parisi L. et al., 2018). Проте з іншого боку розвиток інсулінорезистентності та метаболічне репрограмування (через mTOR) у свою чергу можуть призводити до зрушенням механізмів поляризації макрофагів у інших тканинах та органах, включаючи шкіру, наслідком чого є порушення репаративних процесів та ремоделювання тканин. Так, J.E. Ackerman та співавтори (2017) показали, що при ожирінні та ЦД змінюються механізми поляризації макрофагів із превалюванням М2-фенотипу, що призводить до порушення репарації сухожилок та розвитку фіброзу.

Результати проведеного дослідження свідчать, що формування ФЕП у пацієнтів 2–3-ї груп асоційоване з вираженою активацією М2-макрофагів, і вірогідно, саме цей тип клітин відіграє провідну роль у посиленні ангіогенезу та проліферативних процесів в епідермісі та дермі.

Серед найвірогідніших механізмів порушення поляризації макрофагів може бути метаболічне репрограмування, яке пов’язують перш за все з підвищенням експресії mTOR. Для перевірки гіпотези проведено оцінку експресії цього регулятора сигнальних шляхів у межах ФЕП шкіри у пацієнтів 1–3-ї груп.

Враховуючи асоціацію ФЕП із феноменом інсулінорезистентності, наступним кроком проведено оцінку експресії mTOR у тканинах ФЕП пацієнтів різних груп.

Оцінка експресії mTOR у ФЕП 1-ї групи визначила наявність слабкої позитивної реакції в межах епідермісу (рис. 11) — переважно в межах базального та частини остистого шару, що по суті відображає просторову асоціацію між mTOR та процесом проліферації кератиноцитів. У межах дерми слабку позитивну реакцію виявлено у ділянках обмежених периваскулярних інфільтратів.

Рис. 11.

Експресія mTOR в епідермісі ФЕП пацієнтів 1-ї групи. ІГХД з використанням МАТ до mTOR

а — збільшення у 20; б — у 100 разів.

На відміну від цього, у пацієнтів 2-ї та 3-ї груп відзначено помірну експресію mTOR в епідермісі — у межах базального остистого та зернистого шарів. Крім того, численні mTOR⁺-клітини визначали у дермі — більшою мірою в зонах периваскулярних інфільтратів та у сосочковому шарі (рис. 12). Причому значна кількість mTOR⁺-клітин у сосочковому шарі дерми була асоційована з явищами акантозу та наявністю численних капілярів у ме­жах сосочків поблизу від епідермо-дермальної межі.

Рис. 12.

Експресія mTOR в епідермісі та дермі ФЕП пацієнтів із МС (а, б) та ЦД 2-го типу (в, г). Позитивна реакція на mTOR асоційована із зонами інфільтрації та активного ремоделювання дерми в зоні епідермо-дермальної межі. ІГХД з використанням МАТ до mTOR

Серед mTOR-позитивних клітин визначали слабку та помірну експресію в клітинах фібробластичного ряду. Крім того, поблизу епідермо-дермальної межі виявляли окремі клітини з вираженою експресією mTOR.

М2-макрофаги є джерелом різних факторів росту, включаючи VEGF, FGFb, TGFa та інші, що стимулюють проліферацію фібробластів, кератиноцитів, ангіогенез та продукцію компонентів позаклітинного матриксу (Morris D.L., 2015). Отже, потенційним механізмом морфогенезу ФЕП при ожирінні та ЦД 2-го типу може бути порушення поляризації макрофагів із гіперактивацією М2-типу.

mTORС1/2 відомі як провідні регулятори метаболізму вуглеводів, ліпідів та білків. Посилення експресії mTOR за умов ожиріння асоційоване зі зростанням активності анаболічних процесів та пригніченням аутофагії. На тканинному рівні mTOR залучений у регуляцію процесів проліферації та диференціювання кератиноцитів, регуляцію ангіогенезу та модуляцію запалення (Cornu M. et al., 2013; Samidurai A. et al., 2018; Vergès B., 2018).

Отже інсулінорезистентність асоційована зі зростанням експресії mTOR в епідермісі та up-регуляцією експресії mTOR у клітинах дерми поблизу від епідермо-дермального з’єднання. Це може відображати роль метаболічного репрограмування клітин дерми (перш за все фібробластів) в ініціації процесів ремоделювання, асоційованих із підвищенням проліферації, ангіогенезу та запаленням.

Таким чином, розвиток ФЕП при МС та ЦД 2-го типу асоційований зі зростанням кількості М2-макрофагів на тлі посилення експресії mTOR та VEGF.

Висновок

Формування ФЕП шкіри у пацієнтів із МС та ЦД 2-го типу асоційоване з вираженою активацією М2-макрофагів на тлі посилення експресії серин/треонін протеїнкінази mTOR та VEGF на локальному рівні.

Список використаної літератури

• Горячкина М.В., Белоусова Т.А. (2014) Дерматология. Доброкачественные эпителиальные опухоли кожи. Consilium Medicum, 4: 20–23.
• Молочков В., Хлебникова А. (2006) Доброкачественные эпителиальные опухоли кожи: клиническая картина, лечение. Врач, 2: 39–41.
• Ackerman J.E., Geary M.B., Orner C.A. et al. (2017) Obesity/Type II diabetes alters macrophage polarization resulting in a fibrotic tendon healing response. PLoS One, 12(7): e0181127. doi: 10.1371/journal.pone.0181127.
• Appari M., Channon K.M., McNeill E. (2018) Metabolic Regulation of Adipose Tissue Macrophage Function in Obesity and Diabetes. Antioxid. Redox Signal., 29(3): 297–312. doi: 10.1089/ars.2017.7060.
• Burhans M.S., Hagman D.K., Kuzma J.N. et al. (2018) Contribution of Adipose Tissue Inflammation to the Development of Type 2 Diabetes Mellitus. Compr. Physiol., 9(1): 1–58. doi: 10.1002/cphy.c170040.
• Cornu M., Albert V., Hall M.N. (2013) mTOR in aging, metabolism, and cancer. Curr. Opin. Genet. Dev., 23(1): 53–62. doi: 10.1016/j.gde.2012.12.005.
• Mao Z., Zhang W. (2018) Role of mTOR in Glucose and Lipid Metabolism. Int. J. Mol. Sci., 19(7): E2043. doi: 10.3390/ijms19072043.
• Morris D.L. (2015) Minireview: Emerging Concepts in Islet Macrophage Bio­logy in Type 2 Diabetes. Mol. Endocrinol., 29(7): 946–962. doi: 10.1210/me.2014-1393.
• Parisi L., Gini E., Baci D. et al. (2018) Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J. Immunol. Res., 2018: 8917804. doi: 10.1155/2018/8917804.
• Samidurai A., Kukreja R.C., Das A. (2018) Emerging Role of mTOR Signaling-Related miRNAs in Cardiovascular Diseases. Oxid. Med. Cell Longev., 2018: 6141902. doi: 10.1155/2018/6141902.
• Shi G.J., Shi G.R., Zhou J.Y. et al. (2018) Involvement of growth factors in diabetes mellitus and its complications: a general review. Biomed. Pharmacother., 101: 510–527. doi: 10.1016/j.biopha.2018.02.105.
• Thomas D., Apovian C. (2017) Macrophage functions in lean and obese adipose tissue. Metabolism, 72: 120–143. doi: 10.1016/j.metabol.2017.04.005.
• Tripathy T., Singh B.S.T.P., Kar B.R. (2019) Association of Skin Tag with Metabolic Syndrome and its Components: A Case-control Study from Eastern India. Indian Dermatol. Online J., 10(3): 284–287. doi: 10.4103/idoj.IDOJ_238_18.
• Vergès B. (2018) mTOR and Cardiovascular Diseases: Diabetes Mellitus. Transplantation, 102 (2S Suppl. 1): S47–S49. doi: 10.1097/TP.0000000000001722.

Адреса для листування:
Літус Ірина Олександрівна
04112, Київ, вул. Дорогожицька, 9
Національна медична академія
післядиломної освіти імені П.Л. Шупика,
кафедра дерматовенерології
E-mail: [email protected]

Одержано 07.04.2020