Жодна з інфекційних хвороб сучасності не має такого поширення, як грип. Щороку виникають сезонні епідемії, під час яких в Україні хворіють 3–7 млн людей. За останніми підрахунками Всесвітньої організації охорони здоров’я, щорічно в усьому світі від грипу та його ускладнень помирає до 650 тис. осіб. Під час періодичних пандемій, викликаних генетично новим вірусом, ця кількість суттєво збільшується. Наприклад, у нашій країні, за даними Міністерства охорони здоров’я, під час пандемії 2009 р. офіційно зареєстровано 1127 померлих від грипу А(H1N1)pdm 2009.
Останніми роками є багато нарікань на низьку ефективність протигрипозних вакцин, незважаючи на їх високу якість. Проблема низької ефективності вакцин комплексна. Причин цього явища на сьогодні декілька, основна з них — одночасна циркуляція двох різних генетичних груп вірусів грипу A(H3N2), а саме 3С.2а та 3С.3а. Зазначимо, що віруси цього підтипу частіше за інших викликають епідемії та зазвичай інтенсивніші порівняно з такими, що спричинені іншими типами та підтипами вірусу. Крім того, віруси грипу A(H3N2) є найбільш різноманітними в антигенному та генетичному відношенні. Інфікування ними викликає найбільше ускладнень, особливо в осіб похилого віку та із хронічною патологією. Відомо, що імунна відповідь людей похилого віку на вакцинацію менш інтенсивна, ніж осіб молодшого віку.
Саме через невідповідність складу вакцин та домінуючого збудника епідемії у США щодо компонента A(H3N2), за даними Центрів з контролю та профілактики захворювань (Centers for Disease Control and Prevention — CDC), в сезоні грипу 2017/2018 у США від грипу та його ускладнень померло близько 80 тис. людей, переважно похилого віку та з хронічною патологією. У зв’язку з відмінністю вакцинного та епідемічного штамів вакцина не змогла забезпечити достатній імунний захист. Так, в сезоні грипу 2017/2018 до складу вакцин як компонента A(H3N2) увійшов штам А/Гонконг/4801/2014, що належав до генетичної групи 3С.2а, а переважним збудником епідемії у США виявився штам А/Сінгапур/INFIMH-16-0019/2016, який належав до генетичної підгрупи 3С.2а1. Вакцинний штам міг забезпечити лише 25% імунного захисту від епідемічного на той час штаму.
Тому пошук дієвих противірусних препаратів — це запит суспільства, хоча він вкрай високовартісний і тривалий. Проте ефективні противірусні препарати вдається винайти лише зрідка. Наразі дослідження офіцинальних препаратів на наявність у них противірусних властивостей є шляхом, що спрощує їх впровадження у медичну практику. Амізон® (енісаміум йодид) — саме такий препарат. Його противірусні властивості виявлено вже після початку застосування в медичній практиці у ролі нестероїдного анальгетика та жарознижувального препарату. З 2008 р. розпочалися широкомасштабні як неклінічні, так і клінічні дослідження енісаміуму йодиду. Неклінічні дослідження виконували у відомих науково-дослідних інститутах та лабораторіях Німеччини, Великобританії, Чехії, Нідерландів, Швейцарії та США.
У роботі американських вчених виявлено активність енісаміуму йодиду проти вірусів грипу in vitro, що підтверджує його клінічну ефективність проти вірусу грипу, описану ще попередніми роками (Boltz D. et al., 2018). Так, в експерименті на диференційованих нормальних бронхоепітеліальних клітинах людини (dNHBE) енісаміум йодид інгібував реплікацію декількох підтипів вірусів грипу А, включаючи сезонний А(H1N1), пандемічний А(H1N1)pdm2009, сезонний А(H3N2), пташиний високопатогенний А(H5N1) і пташиний А(H7N9), а також стійкий до інгібіторів нейрамінідази (озельтамівіру і занамівіру) варіант вірусу грипу А(H1N1)pdm2009, що мав мутацію в гені нейрамінідази у положенні H275Y. Енісаміум йодид пригнічував також репродукцію вірусу грипу В у дозах, які у 23–64 рази нижчі за цитотоксичну. Тобто токсичність препарату дуже низька порівняно з ефективними дозами. Показано, що проникність енісаміуму йодиду в епітеліальних клітинах нирок собак MDCK (де противірусної активності не виявлено) становила <0,08%, тоді як набагато вищу проникність спостерігали у клітинах людини dNHBE — 1,9%. Кінетика внутрішньоклітинного поглинання енісаміуму йодиду в диференційованих нормальних бронхоепітеліальних клітинах людини залежить від концентрації. В експерименті з обробки енісаміумом йодидом протягом 4 год після зараження вірусом A(H1N1) спостерігали зниження титрів вірусу грипу в культурі клітин dNHBE у ≥100 разів, що дозволяє припустити вплив препарату саме на ранні стадії життєвого циклу вірусу. Крім того, методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) зі зворотною транскрипцією виявлено пригнічення експресії М-гена вірусу грипу майже на два порядки.
Інша спільна робота авторів з Великобританії, Німеччини, США та України присвячена лікуванню тхорів енісаміумом йодидом (200 мкг/кг 1 раз на добу протягом 7 днів) через 24 год після зараження вірусом А/Вісконсін/67/2005 (H3N2) (Cocking D. et al., 2018). Вибрано саме цих тварин, оскільки при зараженні через повітря (розпилення у ніс) у них виникає захворювання, за клінічною картиною схоже на таке у людини. Причому після одужання утворюються специфічні віруснейтралізуючі антитіла. Застосування енісаміуму йодиду сприяло значному зниженню вірусних титрів у верхніх дихальних шляхах дослідних тварин. Таким чином, оцінка препарату як потенційного противірусного засобу для лікування грипу є цілком обґрунтованою.
У 2010 р. проведено клінічні дослідження на базі ФБДУ «Науково-дослідний інститут грипу» МОЗ РФ (Санкт-Петербург): рандомізовані плацебо-контрольовані клінічні дослідження препарату Амізон® за участю 100 пацієнтів (60 пацієнтів із грипом та гострою респіраторною вірусною інфекцією отримували енісаміум йодид (основна група), 40 — плацебо (контрольна група)). Продемонстровано, що у групі енісаміуму йодиду середній період тривалості лихоманки становив 2,7 дня, у групі плацебо — 3,8 дня. Таким чином, у результаті прийому енісаміуму йодиду тривалість лихоманки скорочувалася в середньому на 1,1 дня. При оцінці самопочуття значне поліпшення стану на 3-й день лікування відзначали 43,3% хворих основної групи та 15% — контрольної (p<0,001). На 7-й день лікування практично всі пацієнти (59 осіб із 60), які застосовували енісаміум йодид, повернулися до звичного способу життя, у той час як 37,5%, які приймали плацебо, продовжували відчувати нездужання і ще не повернулися до звичного режиму праці та відпочинку. Об’єктивно до 3-го дня прийому енісаміуму йодиду у 73% пацієнтів основної групи спостерігали значне зменшення вираженості симптомів захворювання. На 3-й день від початку лікування енісаміумом йодидом симптоми загальної неспецифічної інтоксикації реєстрували у значно меншої кількості пацієнтів, ніж у плацебо-групі. Дослідження проводили із залученням вірусологічної діагностики захворювання.
Нами проведене дослідження щодо визначення противірусних властивостей енісаміуму йодиду в експерименті на культурі клітин стосовно вірусу грипу А(H1N1)pdm 2009. Для проведення досліджень препарат Амізон® (енісаміум йодид) одержано від українського виробника АТ «Фармак». В експерименті використано дві лінії культур клітин: А549 (клітини аденокарциноми легень людини), одержані з банку культур клітин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, та культура клітин MDCK (епітеліальні клітини нирки собаки), одержані з CDC (Атланта, США). У роботі використали вірус грипу А(H1N1)pdm 2009, а саме штам А/Київ/534/2018, виділений у ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського НАМН України» від хворого на грип.
Клітини A549 заражені вірусом А/Київ/534/2018 (H1N1)pdm2009 в концентрації МОІ 2,0. Енісаміум йодид доданий у культуральне середовище в концентраціях 400; 600; 1000 та 2000 µМ за добу до інокуляції вірусу. Експресію М-гена та гена гемаглютиніну (ГГ) у клітинах A549 визначали через 24 год після зараження вірусом грипу за допомогою RT-PCR в режимі реального часу згідно з протоколом CDC. Оскільки виконували ПЛР в режимі реального часу, то підрахунок копій ампліфікованих фрагментів РНК (відносний рівень експресії гена М-білка та ГГ) виконували за формулою:
де n — це цикл, на якому ампліфікаційна крива перетнула поріг.
Додатково одержаний із клітин А549 супернатант інокульовано у високочутливі клітини MDCK, потім визначали титр вірусу в реакції гемаглютинації (РГА) з еритроцитами крові людини 0 групи крові. За титр вірусу вважали те найбільше його розведення, при якому спостерігали позитивну РГА.
Для вирішення питання про значимість вибіркових показників та оцінки вірогідності відмінностей між одержаними показниками результати оброблені статистичним методом за допомогою програми «Excel».
На рис. 1 відображено відносний рівень гена М-білка (або кількість копій фрагмента гена М-білка) в інфікованих клітинах А549 після обробки енісаміум йодидом (400; 600; 1000 та 2000 µМ) порівняно з інфікованими необробленими препаратом клітинами (контроль вірусу). Кількість копій фрагмента гена М-білка вірусу А/Київ/534/2018 (H1N1)pdm2009 була в 7,1 раза менше, ніж у контролі, коли клітини оброблено дозою енісаміуму йодиду 600 µМ. У разі, коли концентрація енісаміуму була 400 µМ, кількість копій фрагмента гена М-білка була у 3,7 раза менша, ніж у контролі. При використанні концентрацій досліджуваного препарату 1000 та 2000 µМ відбувалося повне пригнічення реплікації вірусу і вірус в ПЛР не виявляли. Це свідчить про виражену дозозалежну противірусну дію енісаміуму йодиду щодо вірусу грипу, зокрема його М-білка.
На рис. 2 відображено відносний рівень ГГ (або кількість копій фрагмента ГГ) вірусу грипу в інфікованих клітинах А549 після обробки енісаміумом йодидом (400; 600; 1000 та 2000 µМ) порівняно з інфікованими необробленими препаратом клітинами (контроль вірусу). Кількість копій фрагмента ГГ вірусу А/Київ/534/2018 (H1N1)pdm2009 була в 1,4 раза менше, ніж у контролі, коли клітини оброблено дозою енісаміуму йодиду 400 µМ. Вищі концентрації препарату приводили до повного пригнічення реплікації вірусу і внаслідок цього вірус в ПЛР не виявляли. Це свідчить про пригнічуючий вплив енісаміуму йодиду на утворення гемаглютиніну вірусу грипу в культурі клітин.
Для визначення життєздатності вірусу в супернатанті, що відібрано з клітин А549, ним інокульовані високочутливі до вірусу грипу клітини MDCK, а через 2 доби спостерігали за цитопатичною дією вірусу, а також проводили РГА з метою визначення вірусних титрів. На рис. 3 зображено результати титрування з еритроцитами крові людини 0 групи крові. Видно, що однакові вірусні титри (1:4) спостерігали лише в контролі та у разі використання енісаміуму йодиду в концентрації 400 µМ. При застосуванні вищих концентрацій препарату вірусні титри не виявляли. Цитопатичну дію в культурі клітин MDCK не спостерігали, що також свідчить про повне пригнічення реплікації вірусу енісаміумом.
Для визначення дії енісаміуму йодиду вибрано клітини А549, тому що вони мають достатню проникність для досліджуваного препарату, на відміну від широко використовуваних клітин епітелію нирки собаки MDCK. Хоча клітини MDCK, як відомо, є високочутливими до вірусів грипу, на яких, власне, і проводять виділення вірусів від хворих.
Є низка робіт, які підтверджують факт достатньої чутливості клітин А549 до вірусів грипу (Смирнова Т.Д. и соавт., 2011; Shah Mahmud R., Ilinskaya O.N., 2013; Даниленко Д.М. и соавт., 2016).
Проведені нещодавно дослідження енісаміуму йодиду за кордоном у модельній системі «клітини NHBE — вірус грипу» показали достовірну противірусну дію препарату. Одержані нами результати цілком відповідають таким, отриманим зарубіжними вченими.
Отримані нами дані щодо противірусної дії енісаміуму йодиду стосовно вірусу грипу in vivo на культурі клітин аденокарциноми легень людини А549 повністю збігаються з попередньо проведеними роботами у західних закордонних лабораторіях, зокрема ефект подібний до такого, раніше показаного на культурі клітин dNHBE американськими дослідниками.
Оскільки вираженість клінічного ефекту будь-якого противірусного препарату залежить від своєчасного його застосування, дуже важливо застосовувати ці препарати при перших ознаках захворювання — підвищенні температури тіла і/чи респіраторних симптомах. Наявність у домашній аптечці препарату Амізон® може забезпечити якнайшвидше його застосування та прискорити одужання.
Список використаної літератури
- Даниленко Д.М., Смирнова С.С., Смирнова Т.Д. и др. (2016) Ответ клеток перевиваемых линий карциномы легкого (А-549) и эндотелия (ЕСУ-304) человека на заражение вирусом гриппа А при различной степени инфицированности клеток. Цитология, 5843: 192–200.
- Смирнова Т.Д., Даниленко Д.М., Еропкин M.Ю. и др. (2011) Изучение влияния ремантадина, рибавирина и триазавирина на репродукцию вирусов гриппа А в монослойных и лимфобластоидных клеточных линиях человеческого происхождения. Антибиот. химиотер., 56: 11–12.
- Boltz D., Peng X., Muzzio M. et al. (2018) Activity of enisamium, an isonicotinic acid derivative, against influenza viruses in differentiated normal human bronchial epithelial cells. Antivir. Chem. Chemother., 26: 2040206618811416.
- Cocking D., Cinatl J., Boltz D.A. et al. (2018) Antiviral effect of a derivative of isonicotinic acid enisamium iodide (FAV00A) against influenza virus. Acta Virol., 62(2): 191–195.
- Shah Mahmud R., Ilinskaya O.N. (2013) Antiviral Activity of Binase against the Pandemic Influenza A (H1N1) Virus. Acta Naturae, 5(4): 44–51.
