МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА: ПРИМЕНЕНИЕ НАНОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ В КАРДИОЛОГИИ

ВВЕДЕНИЕ

На протяжении последних пяти лет стремительное развитие в медицине получили технологии прижизненной визуализации с помощью молекулярных зондов (наночастиц), которые коснулись также исследований роли высокоспециализированных наносистем для молекулярного контрастирования как клеточных, так и генных мишеней (Herschman H. B., 2003; Massoud T. F., Gambhir S. S., 2003; Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2005б). Развитие нанотехнологий привело к детальному изучению молекулярных звеньев патогенеза многих заболеваний человека и позволило с молекулярно-клеточных позиций дать современное толкование отдельных патологических процессов, в том числе воспаления, ангиогенеза, тромбообразования и апоптоза (Winter P.M. et al., 2003; Choudhury R. P. et al., 2004; Jaffer F. A., Weissleder R., 2004). С одной стороны, усовершенствование стратегий усиления индуцируемых диагностических сигналов в тканях формировалось за счет оптимизации таких визуализирующих модальностей, как ядерный (Britz-Cunningham S. H., Adelstein S. J., 2003), оптический (Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2005a), ультразвуковой (Дынник О. Б., Залесский В. Н., 2005б), рентгеновский и магнитно-резонансный (МР) (Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2006a, б) форматы томо­графического изображения. С другой — отмечено расширение поиска синтетических контрастных наночастиц, тропных к биомаркерным молекулам-мишеням, необходимым для проведения процедур прижизненной молекулярной визуализации в условиях клиники (Lanza G. M., Wickline S. A., 2003; Winter P. M. et al., 2003).

В аналитическом исследовании основное внимание сосредоточено на развитии соответствующих визуализирующих методик и новых наносистем с целью их последующего применения для прижизненного контрастирования внутриклеточных процессов на молеку­лярном уровне в условиях кардиологической клиники.

НАНОТЕХНОЛОГИИ — ОСНОВА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В КАРДИОЛОГИИ

Нанотехнологии — это современные методы создания и использования специальных биологических материалов и их комбинированных аналогов в составе молекулярных ансамблей в масштабе отдельных клеток, клеточных органелл или транспортерных белоксодержащих комплексов размерами 5–500 нм.

Специфическая организация подобных наноструктур предполагает наличие у них уникальных химических и биологических свойств на основе молекулярных взаимодействий, происходящих на их поверхности. При этом синтетические наноструктуры могут создавать с помощью методов как химического разделения, так и наращивания молекулярных конструкций (Morawski A. M. et al., 2004).

Все молекулярные зонды подразделяют на несколько классов наночастиц. Липосомы — это одно- или многослойные микровезикулярные структуры диаметром 50–700 нм, окруженные липидным биослоем и хорошо известные как переносчики различных лекарственных препаратов. Применение липосом в качестве агентов для молекулярной визуализации позволило достигнуть существенного усиления томо­графического изображения в ультразвуковом и МР форматах (Sipkins D. A. et al., 1998; Demos S. M. et al., 1999).

Эмульсии — химически отличимые от липосом наноструктуры, которые содержат маслянистые везикулы в водной фазе со стабилизирующими молекулами — сурфактантами для поддержания их формы и размеров. Перфторуглеродсодержащие эмульсии (размеры наночастиц 200–400 нм) получили распространение при формировании молекулярного изображения в МР, ультразвуковом, флюоресцентном, ядерном и рентгеновском томографических визуализирующих форматах (Wickline S. A., Lanza G. M., 2002; 2003; Lanza G. M., Wickline S. A., 2003). Например, инкорпорирование значительного количества парамагнитных комплексов гадолиния (>50 000) внутрь водоэмульсионных наночастиц обеспечивало надежное усиление магнитных сигналов при проведении МР- визуализации фибрина в строго очерченных участках предполагаемого разрыва фиброзной по­крышки атеросклеротической бляшки коронарного сосуда благодаря использованию данного парамагнитного экстраклеточного контраста (Flacke S. et al., 2001; Yu X. et al., 2001). Использование технологии укрупнения («bottom-up») рекомбинантных мицеллярных микрочастиц, в том числе липопротеинов низкой и высокой плотности, позволило осуществить процедуру молекулярной визуализации рецепторных реакций, участвующих в атерогенезе (Frias J. C. et al., 2004; Li H. et al., 2004).

Полимеры (размеры наночастиц 40–200 нм) представляют собой достаточно «гибкие» конструктивные биологические элементы для молекулярной сборки диагностических зондов и лечебных транспортерных конструкций (Hawker C. J., Wooley K. L., 2005). Полимеры, синтезированные на основе полигидроксикислот (в том числе «polylactic acid» и «poly(D,L-lactide-coglycolide/PLGA»), исследованы в качестве лекарственных и генных транспортеров (Kolodgie F. D. et al., 2002; Ahrens E. T. et al., 2005). Наряду с этим ден­дримеры (или каскадные полимеры) с глобулярной структурой молекул, а также парамагнитные полиамидоаминовые и диаминобутановые дендримеры обладают хорошей магнетизацией при проведении МР- визуализации (Sato N. et al., 2001; Kobayashi H. et al., 2003). Широкий спектр пространственной геометрии поверхности дендримерных наночастиц способствует формированию большого количества их функциональных участков для взаимодействия со многими лекарственными препаратами, визуализирующими соединениями, а также лигандными молекулами-мишенями.

Металлические микрочастицы, в частности суперпарамагнитные (на основе окиси железа) наноструктуры размерами 15–60 нм, при соединении с дек­страном, фосфолипидами или другими соединениями могут тормозить агрегацию тромбоцитов и восстанавливать процесс дестабилизации атеросклеротической бляшки, связываясь же с макрофагами атеросклеротически измененной стенки сосуда, способны усиливать визуализацию участков локального воспаления при МР- сканировании. Обладая длительным периодом циркуляции (≥24 ч) эти наночастицы также могут быть использованы в качестве молекул для выявления уязвимых атеросклеротических бляшек. Другие металлсодержащие биоконструкции, к которым относят наноструктуры, несущие на своей поверхности микрочастицы золота, имеющие размеры до 120 нм в диаметре, нашли применение в программах молекулярной визуализации и терапии (Loo C. et al., 2004).

Углеродсодержащие наноструктуры, такие как сравнительно недавно открытые нанотрубки и фуллерены (диаметр 4 нм), широко применяют для диагностики состояния поверхностных белков клеточных мембран, а также в качестве визуализирующих молекул на торцовой поверхности оптических биосенсоров при проведении диагностического флюоресцентного сканирования в ближней инфракрасной области спектра с целью молекулярной визуализации процесса фагоцитоза (Cherukuri P. et al., 2004; Barone P. W. et al., 2005).

И, наконец, наноструктуры диаметром 2–8 нм, так называемые QD («quantum dots»)-конструкции, включают такие полупроводниковые частицы, как селенид цинка и отличаются достаточно стабильными флуоресцентными характеристиками для использования различных световых потоков с целью возбуждения свечения накопивших их внутриклеточных структур клетки (Gao X., Nie S., 2005).

ВОЗМОЖНОСТИ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНОЙ ПРИЖИЗНЕННОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ, КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ СТРУКТУР АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК

В основе разрушения бляшки лежит депозиция фибрина. Однако не только с депозицией фибрина связан запуск эрозивного процесса разрушения атеросклеротической поверхности. Этот процесс также связывают с внутрибляшечными геморрагиями и растрескиванием покрышки уязвимой атеросклеротической бляшки. Диагностика разрушенной бляшки связана с процессом депозиции фибрина на ее поверх­ности или в области микротрещин ее покрышки, который часто сопровождается стенозом высоких градаций, определяемым на коронароангио­грамме.

Возможности прижизненной визуализации фибрина на поверхности атеросклеротической бляшки методом формирования наночастицами усиленного ультразвукового и МР-изображения впервые продемонстрированы G. M. Lanza и соавторами в 1996 году. При этом использовали фрагменты антител (обладающие специфичностью к пептидным фрагментам, связывающим молекулы фибрина) с присоединенными к ним лигандными молекулами, которые комплексировались с частицами авидин-биотинового комплекса или присоединялись ковалентными связями к функционирующим наночастицам, выступающим в качестве тканевых мишеней (Lanza G. M. et al., 2000; 2002). Последующую успешную ультразвуковую визуализацию локального микротромбирования удалось провести через 30 мин с применением ультразвукового (7,5 МНz) излучателя (Lanza G. M. et al., 1996).

Сравнительно недавно получены новые данные визуализации количественных изменений уровней экспрессии тканевого фактора (протромботический трансмембранный гликопротеин) в пределах атеросклеротической бляшки как результат посттравматического стентассоциированого процесса рестеноз-зависимого митогенеза методами прижизненного ультразвукового и МР-сканирования (Lanza G. M., Wickline S. A., 2003; Morawski A. M. et al., 2004).

Эхогенность липосом, инициирующих возникновение ультразвуковых сигналов наряду с контрастными наночастицами и эмульсиями, сравнивалась на поверхности жидкости и билипидного слоя. Так, A. Hamilton и соавторы (2002, 2004) применяли липосомы в качестве наночастиц — мишеней для диагностики процессов внутрисосудистого микротромбообразования, а также воспаления при атерогенезе. Процесс связывания молекулярной метки с молекулами межклеточной адгезии- 1 (intercellular adhesion molecule (IСАМ)- 1), сосудистой адгезии-1 (vascular cell adhesion molecule (VCAM)- 1), фибриногена и тканевого фактора зарегистрирован на 5-й минуте после внутривенного введения липосом. МР-визуализация (VCAM- 1) была успешно осуществлена также благодаря использованию процедуры мечения аполипо­протеина Е в эндотелии аорты суперпарамагнитными наночастицами (Kelly K. A. et al., 2005).

В процессе МР- исследования при использова­­нии перфторуглеродных наночастиц, содержащих 50–9000 атомов гадолиния в каждой частице, достигнуто существенное повышение сигналов магнетизации при 1,5 Т МР томографическом сканировании в условиях как in vivo, так и in vitro (Lanza G. M. et al., 1998; Wickline S. A., Lanza G. M., 2003). Кроме того, выявление участков повреждения атеросклеротических бляшек стало возможным благодаря прицельной фиксации наночастиц в зоне покрышки у больных с симптоматическими транзиторными ишемическими атаками, ишемическим инсультом и «уязвимыми» бляшками коронарных сосудов (Flacke S. et al., 2001). Сравнительно недавно компания «Epix Pharmaceuticals» (USA) синтезировала молекулы пептидного лиганда, высокоспецифического для фибрина (EP-2104R), что позволило оптимизировать визуализацию и дать количественную оценку процессу локального микротромбирования на внутренней поверхности сосудов легкого, а также коронарных артерий при проведения процедуры МР- сканирования (Botnar R. M. et al, 2004; Spuentrup E. et al., 2005).

Известно, что α_vβ₃– интегрин относится к числу основных маркеров ангиогенеза и играет важную роль в молекулярных звеньях патогенеза иных заболеваний человека, включая атеросклероз (Kerr J. S. et al., 2001). α_vβ₃-интегрин является молекулой адгезии, которая имеет гетеродимерную структуру и широко экспрессирована на эндотелиоцитах, моноцитах, фибробластах и гладкомышечных клетках сосудистой стенки, а также поддерживает процессы миграции гладкомышечных клеток, межклеточного взаимодействия и ангиогенеза (Bishop G. G. et al., 2001). Оказалось, α_vβ₃– интегрин экспрессируется только на люминальной поверхности активированного эндотелия, а не на мембране интактных эндотелиоцитов (Anderson S. A. et al., 2000). Поэтому мечение наночастицами α_vβ₃– интегрина позволяет проводить прижизненную МР- визуализацию молекул, ассоциированных с процессами экспрессии ростовых факторов, пролиферации и атеросклероза (Winter P. M. et al., 2003).

Отмечена существенная роль ангиогенеза в процессах роста атеросклеротических бляшек и их уязвимости (Tenaglia A. N. et al., 1998; Moulton K. S. et al., 1999). Локальные участки ангиогенеза в области vasa vasorum атеросклеротических изменений стенки аорты у кроликов (находящихся на холестериновой диете) удалось визуализировать методом МР- сканирования на фоне предварительного введения парамагнитных наночастиц для мечения молекул α_vβ₃– интегрина, экспресcированных на активированных эндотелиальных клетках (Winter P. M. et al., 2003). У животных в контроле отсутствовал высокий уровень сигнала магнетизации и отмечена низкая разрешающая способность метода МР- сканирования. В настоящее время интенсивные исследования проводят в области оптимизации процесса прижизненной молекулярной визуализации атеро­склероза. Раннее обнаружение клеточно-молекулярных признаков высокого риска дестабилизации атеросклеротической поверхности артериальных сосудов сердца (в виде картины уязвимости атеросклеротической бляшки) и прижизненная оценка степени стратификации риска возникновения сердечно-сосудистых катастроф (коронарной уязвимости пациента) продолжают оставаться важнейшими проблемами кардиологической науки (Naghavi M. et al., 2003). В этом контексте молекулярная визуализация является полезным инструментом исследования молекулярных звеньев патогенеза атеросклероза, включая локальное воспаление, апоптоз и ангиогенез (Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2005б). Такая структурная трансформация, как высокий риск возникновения разрывов фиброзной покрышки атеросклеротической бляшки, сегодня может быть успешно отслежена в прижизненных условиях методами МРТ, компьютерной томографии, а также внутрисосудистой ультразвуковой и оптической визуализацией (Дынник О. Б., Залесский В. Н., 2005б; Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2005a; 2006а, б), что поз­воляет наиболее точно оценить анатомическую характеристику бляшкоассоциированной атеросклеротической поверхности сосудов. Однако лишь молекулярная визуализация позволяет оптимизировать диагностику степени активности альтеративных процессов на атерогенной поверхности коронарного сосуда и обосновать реальный прогноз возможного развития осложнений атеросклероза.

Подробно изучена активация макрофагов в качестве клеточных эффектов воспаления при атеросклерозе, а их присутствие идентифицировано как предиктор высокого риска его развития (Naghavi M. et al., 2003). Поэтому непосредственная визуализация степени активности макрофагов является важным методом прижизненной оценки степени локального воспаления при атеросклерозе. Установлено, что парамагнитные наночастицы окиси железа связываются с макрофагами атеросклеротически измененной сосудистой стенки и преимущественно накапливаются в бляшках а. carotis (Kooi M. E. et al., 2003; Trivedi R. A. et al., 2004). В этих независимо выполненных исследованиях при проведении каротидной эндартерэктомии предшествующее МР- сканирование на фоне введения наночастиц позволило визуализировать участки локального воспаления в пределах атеросклеротической бляшки. Патогистологический контроль подтвердил данные МР- визуализации, что указывало на преимущественное повышение сигналов магнетизации в области бляшек по сравнению с окружающими структурами сосудистой стенки. Более тонкие клеточно-молекулярные механизмы атеросклеротического процесса были раскрыты при использовании методики магнитофлюоресценции (Kooi M. E. et al., 2003). Будущие успехи в этой области ожидаются в связи с применением молекулярных контрастных соединений, тропных к окисленным липопротеинам низкой плотности, активированным макрофагам и молекулам клеточной адгезии- 1 (VCAM- 1) стенки сосуда (Trivedi R. A. et al., 2004).

Прижизненную визуализацию апоптоза эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток стенки сосудов удалось осуществить методом радиоактивного мечения белка — аннексина (Залесский В. Н. и соавт., 2004). Оказалось, что выявление апоптических клеток в участках атеросклероза может быть достигнуто с помощью модифицированной методики молекулярной визуализации (Naghavi M. et al., 2003). Применение радиомеченного аннексина А5 позволило оценить степень развития апоптоза у больных с инфарктом миокарда (ИМ) (Hofstra L. et al., 2000), а также в тканях сердечного трансплантата после пересадки сердца (Narula J. et al., 2001). Радиомеченный аннексин А5 вводили четырем пациентам с атеросклеротическим поражением а. carotis (Kietselaer B. L. et al., 2004). У первых двух из них отмечено возобновление транзиторных ишемических атак и элевация аннексин А5- зависимого ядерного сигнала на фоне патогистологически подтвержденных процессов макрофагальной инфильтрации и развития внутрибляшечных геморрагий. У двух других больных при отсутствии выраженных клинических проявлений не выявлены достоверные признаки аннексин А5- зависимой картины визуализации, а патогистологические находки свидетельствовали о достаточной степени стабильности атеросклеротического процесса (Kietselaer B. L. et al., 2004).

Визуализацию активности провоспалительных энзимов проводили методом NIRF («near-infrared fluorescence» probe) (Weissleder R. et al., 1999; Chen J. et al., 2002). Наличие ферментов протеолиза атеросклеротических бляшек, в частности матриксных металлопротеиназ и катепсинов, свидетельствовало об альтерации фиброзной покрышки (Libby P., 2002). В рамках вышеизложенных представлений отдельные протеазачувствительные визуализирующие контраст­ные наночастицы способствовали формированию оптимального изображения процесса протеолиза в тканях (Weissleder R. et al., 1999; Tung C. H. et al., 2000; Bremer C. et al., 2001) или детализации особенностей коагуляционного каскада при атеросклерозе (Jaffer F. A. et al., 2002). В сообщении J. Chen и соавторов (2002) отмечены возможности применения проте- а­заактивированного NIRF- зонда в качестве потенциального агента молекулярной визуализации. Это соединение способствовало формированию минимума флюоресценции (свечения) окружающих макрофаги структур. После катепсин В- медиированного расщепления зонда и выхода флюорохрома наружу NIRF- сигналы флюоресценции трансформировались в достаточно яркое свечение белковых структур (Weissleder R. et al., 1999). Этот принцип используют для визуализации макрофаг- и кетепсин В- зависимых процессов локального воспаления в участках атеросклеротических изменений (Chen J. et al., 2002). При этом детектирование атеросклерозассоциированных NIRF- сигналов проводят с применением метода флуоресцентной молекулярной томографии (Ntziachristos V. et al., 2002). В последнее время успешную активацию молекулярных зондов удалось осуществить при использовании внутрисосудистой NIRF- ассоциированной катетеризации сердца (Jaffer F. A., Weissleder R., 2004).

НАНОЧАСТИЦЫ — ЭФФЕКТИВНЫЕ МЕТКИ КАРДИОМИОЦИТОПОДОБНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (СК)

Наиболее эффективными метками молекул — мишеней СК явились получившие распространение в последние годы магнитодендримеры (magnetodendrimers), в частности MD- 100 (Bulte J. W. et al., 2001), представляющие комплексы наночастиц окиси железа, присоединенные к карбоксилированным дендримерам (4–5- й генерации). Известна способность ден­дримеров обеспечивать надежную трансфекцию олигонуклеотидов в клетку (De Cuyper M., Bulte J. W. (Eds.), 2001). Высокая насыщаемость полимерами участков клеточной мембраны в месте их присоединения инициирует ее выпячивание внутрь клетки и развитие механизма эндоцитоза («membrane bending») (Zhang Z. Y., Smith B. D., 2000). Оказалось, что СК, взятые от мыши, крысы и человека, могут сравнительно просто быть помечены простым прибавлением к среде MD- 100 в концентрации окиси же­ле­за, равной 10–25 мг Fе/ мл (Bulte J. W. et al., 2001). Причем перечень различных клеточных линий, подлежащих мечению MD- 100, не лимитирован и включает фибробласты, прогениторные мышечные клетки и СК у мышей, олигодендроглиальные прогениторные клетки у крыс, кардиомиоцитоподобные и эмбриональные СК у человека. Все перечисленные линии клеток отличаются достаточно высокой степенью накопления МР контрастных наночастиц в пределах эндосом, демонстрируя неселективную природу ретенции в них MD- 100 (Bulte J. W. et al., 2001; Walter G. A. et al., 2004).

Сравнительно недавно (Frank J. A. et al., 2003; Kalish H. et al., 2003) был разработан новый метод магнетизации СК, основанный на использовании молекулярных конструкций в составе агентов для осуществления трансфекции и наночастиц USPIO (ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide), в частности Feridex (Kalish H. et al., 2003) или Sinerem (Hoehn M. et al., 2002). После присоединения этих комплексов к клеткам культуры, трансфецирующие агенты осуществляли эффективную «челночную» передачу USPIO в СК путем образования эндосом. В настоящее время препараты для трансфекции находятся на разных стадиях клинических испытаний и включают такие коммерческие образцы, как денд­ример Superfect, поли-L-лизин (poly-L-lysine/PLL), Lipofectamine, Lipofectin, Fugene, а также ряд других соединений (Moore A. et al., 2001; Bulte J. W. et al., 2002; Daldrup-Link H. E. et al., 2003).

Мечение СК препаратом PLL-Feridex позволяет достигнуть уровня накопления наночастиц окиси железа в диапазоне 10–25 пг Fe в клетке (Frank J. A. et al., 2003). В то же время показано, что PLL- Feridex-мечение не влияло на выживаемость и пролиферативную активность мезенхимальных и кардиомиоцитоподобных СК человека (Frank J. A. et al., 2003; Kraitchman D. L. et al., 2003), а также не оказывало отрицательного воздействия на дифференцировку мезенхимальных СК в кардиомиоциты, адипоциты и остеоциты (Kraitchman D. L. et al., 2003; Kostura L. et al., 2004).

Сегодня становится очевидным тот факт, что центральным звеном будущих лечебных программ использования методов трансплантации СК в кардио-логии могут стать проблемы контроля миграции СК от места их введения к очагу поражения, а также оценки их жизнеспособности на протяжении длительного периода после трансплантации, связанные с регенеративными свойствами СК. Достаточно отчетливо обозначилось направление исследований по пересадке и визуализации стволовых и прогениторных клеток (in vivo) с целью клеточной репарации в пределах ишемизированных тканей после перенесенного ИМ у человека (Assmus B. et al., 2002; Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2004). Оно включает введение гематопоэтических СК костного мозга, эндотелиоцитоподобных, кардиомиоцитоподобных СК, а также мезенхимальных СК и миогенных сателлитных клеток (Залесский В. Н., Дынник О. Б., 2004). Все перечисленные линии клеток могут способствовать развитию стромы органа, поддержке неоангиогенеза и образованию новых функционирующих кардиомио­цитов взамен погибших (Дынник О. Б., Залесский В. Н., 2005а). Это позволило на модели ИМ у собак и морских свинок оценить состояния МР-чувствительности кардиомиоцитоподобных СК после их внутримиокардиального введения (Dick A. J. et al., 2003; Hill J. M. et al., 2003; Kraitchman D. L. et al., 2003; Sorger J. M. et al., 2003), а также после их введения в периферический кровоток (Lanza G. M. et al., 1996; Sorger J. M. et al., 2003).

Появилась надежда достаточно длительной визуализации процесса миграции, приживления и дифференцировки мезенхимальных СК на протяжении многих месяцев после трансплантации, а также отслеживания места нахождения СК с одновременной МР- визуализацией миокардиальных функций и диагностикой изменений в зоне ИМ.

Оказалось, что СК-ассоциированные трансмиграционные события в эксперименте на крупных лабораторных животных (собаки, свиньи) после пересадки СК (под контролем рентгенофлюоресценции и МР- сканирования) сходны с процессом дистанционирования СК, визуализируемым у человека. Кроме того, применяемые протоколы МР- визуализации на крупных животных в эксперименте оказались практически идентичными условиям 1,5 Т МР- сканирования у человека и продемонстрировали возможность и необходимость проведения многоцентровых рандомизированных исследований по безопасности использования СК-ассоциированных наночастиц в клинике, отсутствующих до настоящего времени. В условиях эксперимента на крупных животных меченные флуоресцентными частицами окиси железа мезенхемальные СК удалось визуализировать в миокарде в виде участков гипоинтенсивного МР- изображения при напряженности магнитного поля 1,5 Т (Hill J. M. et al., 2003). Через 3 нед участки гипоинтенсивности были отчетливо различимы и отличались устойчивой МР- визуализацией в миокарде еще на протяжении 12 нед посттрансплантационного перио­да наблюдения.

В аналогичной работе D. L. Kraitchman и соавторов (2003) проведение процедуры трансэндокардиальной Feridex- PLL- ассоциированной магнетизации мезенхимальных СК способствовало расширению (на 15%) участков гипоинтенсивности через одну неделю после клеточной трансплантации, что согласовывалось со снижением контрастности изображения на 24% и свидетельствовало об активации процесса миграции мезенхимальных СК. Мечение мезенхимальных СК МР- контрастными наночастицами с флуоресцентными маркерными молекулами позволило получить согласованные с проведенным патогистологическим анализом данные о ретенции существенно большего количества наночастиц окиси железа в СК в месте инъекции, чем в фагоцитах по периферии. Существенным недостатком рентгенофлюоресцентного контроля доставки СК в очаг повреждения для клеточной кардиомиопластики является неспособность определения эффективности выполнения трансплантации СК. Поэтому использование МР  томографического сканирования с контрастным усилением (Kraitchman D. L. et al., 2003) позволило устранить этот недостаток и провести неинвазивную (с высоким пространственным разрешением) визуализацию заключительных этапов миграции СК в пределах инфар­цированных очагов миокарда.

И, наконец, специальный МР  контрастный катетер был использован с целью прицельной доставки СК (меченных МР  контрастными наночастицами) в зону инфарктзависимой коронарной артерии с терапевтической целью (Lederman R. J. et al., 2002; Karmarkar P. V. et al., 2004). МР  контролируемая катетерная доставка Feridex-меченных мезенхимальных СК позволяла визуализировать специфические молекулы-мишени по периферии зоны инфарктизации, в периинфарктных участках миокарда с интенсивным развивающимся апоптозом кардиомиоцитов. При этом визуальная трансформация участков гипоинтенсивности из яйцевидной в линейные формы на МР- сканограммах по мнению авторов (Kraitchman D. L. et al., 2003) могла свидетельствовать о локальной миграции СК в зону ИМ и регистрировалась на протяжении 8 нед наблюдения после клеточной трансплантации.

В целом, данные литературы по МР  контрастной визуализации процесса миграции мезенхимальных и кардиомиоцитоподобных СК крайне ограничены, а материалы по применению других методов (компьютерная томография, ультразвуковая визуализация, оптическая когерентная томография) контрастассоциированной визуализации дистанцирования СК не выявлены. Кроме того, полученные в единичных центрах результаты пока слабо репродуцируются другими последовательными лабораториями. К тому же имеют место различные технологические и методические ограничения метода применения МР  контрастных наночастиц окиси железа для молекулярной и клеточной визуализации (Wickline S. A., Lanza G. M., 2002). Среди них снижение интенсивности магнетизации активированных наночастицами молекулярных мишеней, которое возникает по типу образования «черных дыр» («black holes») в результате: 1) помех, наведенных непосредственно анатомическим форматом изображения в тканях при наложении сканограмм пре- и постконтрастной визуализации; 2) возникновения дискриминационных отношений между МР  контрастным изображением молекул-мишеней и клеточных мишеней (в том  числе по причине не­адекватного использования импульсных последовательностей при МР- сканировании). Отмечено, что применение новой импульсной по­следовательности (spoiled gradient echo/SPGR, «white marker») позволит повысить позитивный визуализующий потенциал SPIO- контрастных СК (Wickline S. A., Lanza G. M., 2003). К тому же обнаружено, что МР  контрастная визуализация клеточных мишеней перманентна, в то время как саморепликация репортерных генов (в частности lac Z) происходит на фоне «растворения» их меток благодаря процессам роста и дифференцировки. Это приводит к тому, что МР  контрастная визуализация генов на основе применения наночастиц окиси железа остается пока несовершенной как in vitro, так и in vivo (Bulte J. W. et al., 2001), что инициирует поиск новых более эффективных методов для визуализации экспрессии репортерных генов СК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярная визуализация в медицине — интенсивно развивающаяся область знаний, которая может позволить повысить интерес практических врачей к молекулярным основам патогенеза многих заболеваний человека. В работе предпринята первая попытка оценки релевантности применения нанотехнологий для визуализации в кардиологии. Существенный интерес следует ожидать в создании мультимодальных наночастиц, усиливающих контрастность изображения, а также технических средств и алгоритмов оптимизации методов визуализации молекулярных процессов, что позволит повысить эффективность методов молекулярной терапии в кардиологии.

ЛИТЕРАТУРА

• Дынник О.Б., Залесский В.Н. (2005а) Апоптоз и инфаркт миокарда: роль стволовых клеток в регенерации мышцы сердца. Укр. кардіол. журн., 3: 127–131.
• Дынник О.Б., Залесский В.Н. (2005б) Внутрикоронарная ультразвуковая томографическая визуализация (проблемы и перспективы). Укр. мед. часопис, 5(49): 89–94 (http://www.umj.com.ua/pdf/49/1817.pdf).
• Залесский В.Н., Дынник О.Б. (2004) Эндотелиоцитоподобные стволовые клетки и их антиишемический потенциал. Кровообіг та гемостаз, 2–3: 20–26.
• Залесский В.Н., Дынник О.Б. (2005а) Внутрисосудистая оптическая когерентная томография: возможности визуализации коронарной патологии. Укр. мед. часопис, 6(50): 42–46 (http://www.umj.com.ua/pdf/50/1842.pdf).
• Залесский В.Н., Дынник О.Б. (2005б) Молекулярная визуализация в медицине. Проблемы и перспективы. Укр. мед. часопис, 2(46): 76–83 (http://www.umj.com.ua/pdf/46/1749.pdf).
• Залесский В.Н., Дынник О.Б. (2006а) Визуализация кальциноза методом спиральной компьютерно-томографической коронароангиографии. Укр. мед. часопис, 3(53): 78–83 (http://www.umj.com.ua/pdf/53/1866.pdf).
• Залесский В.Н., Дынник О.Б. (2006б) Магнитно-резонансная коронароангиография. Укр. кардіол. журн., 2: 103–107.
• Залесский В.Н., Фильченков А.А., Дынник О.Б. (2004) Методы визуализации апоптоза. Журнал АМН Украины, 10(2): 326–328.
• Ahrens E.T., Flores R., Xu H., Morel P.A. (2005) In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol., 23(8): 983–987.
• Anderson S.A., Rader R.K., Westlin W.F. et al. (2000) Magnetic resonance contrast enhancement of neovasculature with alpha(v)beta(3)-targeted nanoparticles. Magn. Reson. Med., 44(3): 433–439.
• Assmus B., Schächinger V., Teupe C. et al. (2002) Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation, 106(24): 3009–3017.
• Barone P.W., Baik S., Heller D.A., Strano M.S. (2005) Near-infrared optical sensors based on single-walled carbon nanotubes. Nat. Mater., 4(1): 86–92.
• Bishop G.G., McPherson J.A., Sanders J.M. et al. (2001) Selective alpha(v)beta(3)-receptor blockade reduces macrophage infiltration and restenosis after balloon angioplasty in the atherosclerotic rabbit. Circulation, 103(14): 1906–1911.
• Botnar R.M., Buecker A., Wiethoff A.J. et al. (2004) In vivo magnetic resonance imaging of coronary thrombosis using a fibrin-binding molecular magnetic resonance contrast agent. Circulation, 110(11): 1463–1466.
• Bremer C., Tung C.H., Weissleder R. (2001) In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nat. Med., 7(6): 743–748.
• Britz-Cunningham S.H., Adelstein S.J. (2003) Molecular targeting with radionuclides: state of the science. J. Nucl. Med., 44(12): 1945–1961.
• Bulte J.W., Douglas T., Witwer B. et al. (2001) Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol., 19(12): 1141–1147.
• Bulte J.W., Duncan I.D., Frank J.A. (2002) In vivo magnetic resonance tracking of magnetically labeled cells after transplantation. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22(8): 899–907.
• Chen J., Tung C.H., Mahmood U. et al. (2002) In vivo imaging of proteolytic activity in atherosclerosis. Circulation, 105(23): 2766–2771.
• Cherukuri P., Bachilo S.M., Litovsky S.H., Weisman R.B. (2004) Near-infrared fluorescence microscopy of single-walled carbon nanotubes in phagocytic cells. J. Am. Chem. Soc., 126(48): 15638–15639.
• Choudhury R.P., Fuster V., Fayad Z.A. (2004) Molecular, cellular and functional imaging of atherothrombosis. Nat. Rev. Drug. Discov., 3(11): 913–925.
• Daldrup-Link H.E., Rudelius M., Oostendorp R.A. et al. (2003) Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology, 228(3): 760–767.
• De Cuyper M., Bulte J.W. (Eds.) (2001) Physics and Chemistry Basis of Biotechnology. Series: Focus on Biotechnology , Vol. 7. Springer, 334 p.
• Demos S.M., Alkan-Onyuksel H., Kane B.J. et al. (1999) In vivo targeting of acoustically reflective liposomes for intravascular and transvascular ultrasonic enhancement. J. Am. Coll. Cardiol., 33(3): 867–875.
• Dick A.J., Guttmann M.A., Raman V.K. et al. (2003) Real-time MRI enables targeted injection of labeled stem cells to the border of recent porcine myocardial infarction based on functional and tissue characteristics. Proc. Intl. Soc. Magn. Reson. Med., 11: 365.
• Flacke S., Fischer S., Scott M.J. et al. (2001) Novel MRI contrast agent for molecular imaging of fibrin: implications for detecting vulnerable plaques. Circulation, 104(11): 1280–1285.
• Frank J.A., Miller B.R., Arbab A.S. et al. (2003) Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology, 228(2): 480–487.
• Frias J.C., Williams K.J., Fisher E.A., Fayad Z.A. (2004) Recombinant HDL-like nanoparticles: a specific contrast agent for MRI of atherosclerotic plaques. J. Am. Chem. Soc., 126(50): 16316–16317.
• Gao X., Nie S. (2005) Quantum dot-encoded beads. Methods Mol. Biol., 303: 61–71.
• Hamilton A., Huang S.L., Warnick D. et al. (2002) Left ventricular thrombus enhancement after intravenous injection of echogenic immunoliposomes: studies in a new experimental model. Circulation, 105(23): 2772–2778.
• Hamilton A.J., Huang S.L., Warnick D. et al. (2004) Intravascular ultrasound molecular imaging of atheroma components in vivo. J. Am. Coll. Cardiol., 43(3): 453–460.
• Hawker C.J., Wooley K.L. (2005) Convergence of synthetic organic and polymer chemistries. Science, 309(5738): 1200–1205.
• Herschman H.B. (2003) Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science, 302(5645): 605–608.
• Hill J.M., Dick A.J., Raman V.K. et al. (2003) Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells. Circulation, 108(8): 1009–1014.
• Hoehn M., Küstermann E., Blunk J. et al. (2002) Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(25): 16267–16272.
• Hofstra L., Liem I.H., Dumont E.A. et al. (2000) Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction. Lancet, 356(9225): 209–212.
• Jaffer F.A., Tung C.H., Gerszten R.E., Weissleder R. (2002) In vivo imaging of thrombin activity in experimental thrombi with thrombin-sensitive near-infrared molecular probe. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22(11): 1929–1935.
• Jaffer F.A., Weissleder R. (2004) Seeing within: molecular imaging of the cardiovascular system. Circ. Res., 94(4): 433–445.
• Kalish H., Arbab A.S., Miller B.R. et al. (2003) Combination of transfection agents and magnetic resonance contrast agents for cellular imaging: relationship between relaxivities, electrostatic forces, and chemical composition. Magn. Reson. Med., 50(2): 275–282.
• Karmarkar P.V., Kraitchman D.L., Izbudak I. et al. (2004) MR-trackable intramyocardial injection catheter. Magn. Reson. Med., 51(6): 1163–1172.
• Kelly K.A., Allport J.R., Tsourkas A. et al. (2005) Detection of vascular adhesion molecule-1 expression using a novel multimodal nanoparticles. Circ. Res., 96(3): 327–336.
• Kerr J.S., Mousa S.A., Slee A.M. (2001) Alpha(v)beta(3) integrin in angiogenesis and restenosis. Drug News Perspect., 14(3): 143–150.
• Kietselaer B.L., Reutelingsperger C.P., Heidendal G.A. et al. (2004) Noninvasive detection of plaque instability with use of radiolabeled annexin A5 in patients with carotid-artery atherosclerosis. N. Engl. J. Med., 350(14): 1472–1473.
• Kobayashi H., Kawamoto S., Jo S.K. et al. (2003) Macromolecular MRI contrast agents with small dendrimers: pharmacokinetic differences between sizes and cores. Bioconjug. Chem., 14(2): 388–394.
• Kolodgie F.D., John M., Khurana C. et al. (2002) Sustained reduction of in-stent neointimal growth with the use of a novel systemic nanoparticle paclitaxel. Circulation, 106(10): 1195–1198.
• Kooi M.E., Cappendijk V.C., Cleutjens K.B. et al. (2003) Accumulation of ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide in human atherosclerotic plaques can be detected by in vivo magnetic resonance imaging. Circulation, 107(19): 2453–2458.
• Kostura L., Kraitchman D.L., Mackay A.M. et al. (2004) Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR Biomed., 17(7): 513–517.
• Kraitchman D.L., Heldman A.W., Atalar E. et al. (2003) In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation, 107(18): 2290–2293.
• Lanza G.M., Abendschein D.R., Hall C.S. et al. (2000) In vivo molecular imaging of stretch-induced tissue factor carotid arteries with ligand-targeted nanoparticles. J. Am. Soc. Echocardiogr., 13(6): 608–614.
• Lanza G.M., Trousil R.L., Wallace K.D. et al. (1998) In vitro characterization of a novel, tissue-targeted ultrasonic contrast system with acoustic microscopy. J. Acoust. Soc. Am., 104(6): 3665–3672.
• Lanza G.M., Wallace K.D., Scott M.J. et al. (1996) A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation, 94(12): 3334–3340.
• Lanza G.M., Wickline S.A. (2003) Targeted ultrasonic contrast agents for molecular imaging and therapy. Curr. Prob. Cardiol., 28(12): 625–653.
• Lanza G.M., Yu X., Winter P.M. et al. (2002) Targeted antiproliferative drug delivery to vascular smooth muscle cells with a magnetic resonance imaging nanoparticle contrast agent: implications for rational therapy of restenosis. Circulation, 106(22): 2842–2847.
• Lederman R.J., Guttman M.A., Peters D.C. et al. (2002) Catheter-based endomyocardial injection with real-time magnetic resonance imaging. Circulation, 105(11): 1282–1284.
• Li H., Gray B.D., Corbin I. et al. (2004) MR and fluorescent imaging of low-density lipoprotein receptors. Acad. Radiol., 11(11): 1251–1259.
• Libby P. (2002) Inflammation in atherosclerosis. Nature, 420(6917): 868–874.
• Loo C., Lin A., Hirsch L. et al. (2004) Nanoshell-enabled photonics-based imaging and therapy of cancer. Technol. Cancer Res. Treat., 3(1): 33–40.
• Massoud T.F., Gambhir S.S. (2003) Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev., 17(5): 545–580.
• Moore A., Josephson L., Bhorade R.M. et al. (2001) Human transferrin receptor gene as a marker gene for MR imaging. Radiology. 221(1): 244–250.
• Morawski A.M., Winter P.M., Crowder K.C. et al. (2004) Targeted nanoparticles for quantitative imaging of sparse molecular epitopes with MRI. Magn. Reson. Med., 51(3): 480–486.
• Moulton K.S., Heller E., Konerding M.A. et al. (1999) Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovascularization and plaque growth in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation, 99(13): 1726–1732.
• Naghavi M., Libby P., Falk E. et al. (2003) From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation, 108(14): 1664–1672.
• Narula J., Acio E.R., Narula N. et al. (2001) Annexin-V imaging for noninvasive detection of cardiac allograft rejection. Nat. Med., 7(12): 1347–1352.
• Ntziachristos V., Tung C.H., Bremer C., Weissleder R. (2002) Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat. Med., 8(7): 757–760.
• Sato N., Kobayashi H., Hiraga A. et al. (2001) Pharmacokinetics and enhancement patterns of macromolecular MR contrast agents with various sizes of polyamidoamine dendrimer cores. Magn. Reson. Med., 46(6): 1169–1173.
• Sipkins D.A., Cheresh D.A., Kazemi M.R. et al. (1998) Detection of tumor angiogenesis in vivo by alphaVbeta3-targeted magnetic resonance imaging. Nat. Med., 4(5): 623–626.
• Sorger J.M., Despress D., Schimel D. et al. (2003) MRI tracking of stem cells homing to myocardial infarction. Proc. Intl. Soc. Magn. Reson. Med., 11: 364.
• Spuentrup E., Fausten B., Kinzel S. et al. (2005) Molecular magnetic resonance imaging of atrial clots in a swine model. Circulation, 112(3): 396–399.
• Tenaglia A.N., Peters K.G., Sketch M.H. Jr, Annex B.H. (1998) Neovascularization in atherectomy specimens from patients with unstable angina: implications for pathogenesis of unstable angina. Am. Heart J., 135(1): 10–14.
• Trivedi R.A., U-King-Im J.M., Graves M.J. et al. (2004) In vivo detection of macrophages in human carotid atheroma: temporal dependence of ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide-enhanced MRI. Stroke, 35(7): 1631–1635.
• Tung C.H., Mahmood U., Bredow S., Weissleder R. (2000) In vivo imaging of proteolytic enzyme activity using a novel molecular reporter. Cancer Res., 60(17): 4953–4958.
• Walter G.A., Cahill K.S., Huard J. et al. (2004) Noninvasive monitoring of stem cell transfer for muscle disorders. Magn. Reson. Med., 51(2): 273–277.
• Weissleder R., Tung C.H., Mahmood U., Bogdanov A. Jr (1999) In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat. Biotechnol., 17(4): 375–378.
• Wickline S.A., Lanza G.M. (2002) Molecular imaging, targeted therapeutics, and nanoscience. J. Cell. Biochem., 39(Suppl.): 90–97.
• Wickline S.A., Lanza G.M. (2003) Nanotechnology for molecular imaging and targeted therapy. Circulation, 107(8): 1092–1095.
• Winter P.M., Morawski A.M., Caruthers S.D. et al. (2003) Molecular imaging of angiogenesis in early-stage atherosclerosis with alpha(v)beta3-integrin-targeted nanoparticles. Circulation, 108(18): 2270–2274.
• Yu X., Caruthers S.D., Love S.M. et al. (2001) Rapid and sensitive thrombus detection with a fibrin-targeted nanoparticle MRI contrast agent. Circulation, 104: 1635.
• Zhang Z.Y., Smith B.D. (2000) High-generation polycationic dendrimers are unusually effective at disrupting anionic vesicles: membrane bending model. Bioconjug. Chem., 11(6): 805–814.

Адрес для переписки:
Залесский Вячеслав Николаевич
03151, Киев, ул. Народного ополчения, 5
Национальный научный центр «Институт
кардиологии им. Н.Д. Стражеско»,
АМН Украины