Асоціація Pro12Ala поліморфізму гена PPAR-γ з біохімічними показниками крові, цитокіновим і адипокіновим профілями та структурно-функціональними параметрами печінки у пацієнтів із неалкогольною жировою хворобою печінки

Вступ

Неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) сьогодні є найпоширенішою нозологією серед захворювань печінки, яку діагностують у 20–30% дорослого населення країн Західної Європи та Північної Америки та 15% — Азії (Bellentani S. et al., 2010; Бабак О.Я. та співавт., 2011; Conlon B.A. et al., 2011; Williams R. et al., 2014). Зокрема, у США ознаки НАЖХП визначають у 34% дорослого населення, у дітей поширеність захворювання становить 3–10% (Browning J.D. et al., 2004). Серед причин, які спричиняють розвиток НАЖХП, виділяють метаболічний синдром, цукровий діабет 2-го типу, синдром інсулінорезистентності, дисліпідемію, ожиріння, швидке зменшення маси тіла, парентеральне харчування тощо (Ratziu V. et al., 2010; Харченко Н.В. та співавт., 2011). Поряд із загальновідомими факторами виникнення НАЖХП, окремі вчені звертають увагу на генетичні чинники, які можуть впливати на розвиток та прогресування цього захворювання. Y.J. Zhou та співавтори (2010) виокремлюють кілька груп генів-кандидатів, які можуть бути залучені у патогенез НАЖХП. Перш за все, це гени, пов’язані з розвитком інсулінорезистентності, зокрема ті, що визначають синтез адипонектину, резистину, інсулінових рецепторів, рецепторів — активаторів проліферації пероксисом (peroxisome proliferator-activated receptors — PPARs)-γ. Другу групу становлять гени, які впливають на печінковий метаболізм ліпідів, серед яких — ген печінкової ліпази, лептину, PPAR-α, цитохрому Р450 (CYP) 2E1 і 4А. До третьої групи входять гени, пов’язані з синтезом цитокінів, зокрема фактора некрозу пухлини (tumor necrosis factor — TNF)-α та інтерлейкіну (interleukin — IL)-10. До четвертої групи відносять гени, які визначають експресію чинників, що впливають на процеси фіброгенезу, зокрема трансформуючого фактора росту (transforming growth factor — TGF)-β₁, фактора росту сполучної тканини (connective tissue growth factor). До п’ятої групи належать гени, які кодують експресію рецепторів до ендотоксинів, серед яких Toll-подібний рецептор-4.

У ряді досліджень показаний зв’язок поліморфних варіантів різних генів із активністю цитокінів, медіаторів фіброгенезу та інсулінорезистентності, активних форм кисню (Osterreicher C.H., Brenner D.A., 2007; Wilfred de Alwis N.M., Day C.P., 2007; Zhou Y.J. et al., 2010). Зокрема виявлено, що поліморфні варіанти генів, які визначають експресію TNF-α, адипонектину, лептину, PPAR, фосфатидил­етаноламін-N-метилтрансферази і печінкової ліпази, пов’язані зі сприйнятливістю до розвитку НАЖХП (Zhou Y.J. et al., 2010).

Одними з найважливіших генів, які впливають на адипо- та фіброгенез, є гени, які кодують синтез PPAR (Boitier E. et al., 2003). PPAR відіграють ключову роль у моделюванні синтезу, депонуванні та транс­портуванні печінкових триацилгліцеролів, отже, здатні впливати на розвиток та перебіг НАЖХП. Відомо про кілька поліморфних варіантів гена PPAR-γ, які пов’язані зі схильністю до розвитку метаболічного синдрому та його окремих складових, серед яких і НАЖХП (Semple R.K. et al., 2006). Зокрема, Y. Hui та співавтори (2008) дійшли висновку, що носійство T-алеля гена PPAR-γ (C161T) пов’язане з більш високою схильністю до розвитку цього захворювання. C.Y. Cao та спів­автори (2012) встановили, що GG-генотип (C681G) зазначеного гена також пов’язаний із вищим ризиком розвитку НАЖХП.

Мета дослідження — визначити можливий зв’язок Pro12Ala поліморфного варіанта гена PPAR-γ з біохімічними показниками крові, цитокіновим і адипокіновим профілями та структурно-функціональними параметрами печінки у пацієнтів із НАЖХП.

Об’єкт і методи дослідження

Досліджено Pro12Ala поліморфізм гена PPAR-γ у 104 пацієнтів із НАЖХП та 45 практично здорових осіб (контрольна група). Усі пацієнти та практично здорові волонтери дали письмову інформовану згоду на участь у дослідженні. Верифікацію діагнозу НАЖХП проводили згідно з наказом Міністерства охорони здоров’я України від 06.11.2014 р. № 826 і адаптивної клінічної настанови, заснованої на доказах, «Неалкогольна жирова хвороба печінки» та настанови Європейських асоціацій по вивченню захворювань печінки/цукрового діабету/ожиріння (European Association for the Study of the Liver/European Association for the Study of Diabetes/European Association for the Study of Obesity — EASL/EASD/EASO) щодо лікування НАЖХП (МОЗ України, 2014; European Association for the Study of the Liver (EASL) et al., 2016).

Кров у пацієнтів збирали вранці натще з ліктьової вени. У ролі антикоагулянта використовували 5% розчин етилендіамінтетраацетату динатрієвої солі. Біохімічні дослідження крові проводили на біохімічному аналізаторі «Accent-200» («Cormay S.A.», Польща) за допомогою стандартних реактивів та методик на базі лабораторії Чернівецького обласного діагностичного центру. Визначення показників цитокінового та адипокінового профілів здійснювали за допомогою імуноферментного аналізатора «Statfax 303/Plus» («Awareness Technology Inc.», США). У крові обстежених пацієнтів та практично здорових осіб визначали рівень TNF-α («Bender MedSystems GmbH», Австрія), IL-10 («Bender MedSystems GmbH», Австрія), TGF-β₁ («Bender MedSystems GmbH», Австрія), лептину («Diagnostics Biochem Canada Inc», Канада), адипонектину («BioVendor — Laboratorni medicina», Чеська Республіка), передсердного натрій­уретичного пропетиду (proANP) («Biomedica», Австрія).

Дослідження Pro12Ala поліморфізму гена PPAR-γ проводили у Державному закладі «Референс-центр з молекулярної діагностики МОЗ України» (Київ). Геномну ДНК для молекулярно-генетичного дослідження виділяли з периферичної крові за допомогою комерційної тест-системи «innuPREP Blood DNA Mini Kit» («Analytik Jena», Німеччина) з використанням центрифужних фільтрів. Для визначення поліморфних варіантів генів PPAR-γ (Pro12Ala) rs 1801282 використовували модифіковані протоколи із застосуванням методу полімеразної ланцюгової реакції та подальшим аналізом поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (Canbay E. et al., 2012). Продукти ампліфікації фрагментів ДНК генів PPAR-γ підлягали гідролітичному розщепленню за допомогою ендонуклеаз рестрикції BstUI та Alw261 (BsmAI) («Thermo Scientific», США). Стан ампліфікаційних фрагментів аналізували в 2% агарозному гелі, а рестрикційних фрагментів PPAR-γ (Pro12Ala) — у 3% агарозному гелі (агароза фірми «Cleaver Scientific», Великобританія) з додаванням бромистого етидію, маркера молекулярної маси «GeneRuler 50 bp DNA Ladder» («Thermo Scientific», США) та подальшою візуалізацією у трансілюмінаторі за допомогою комп’ютерної програми «Vitran». Як видно (рисунок), амплікони ділянки гена PPAR-γ підлягали гідролітичному розщепленню за наявності сайта рестрикції 5’…CG↓CG…3’, внаслідок чого утворювалися рестрикти молекулярною масою 227 та 43 п.н. (генотип Ala/Ala).

Рисунок. Електрофореграма розподілу ампліфікованих фрагментів гена PPARγ

Тип розподілу даних визначали за порівнянням середньої арифметичної, моди і медіани та за допомогою тесту Шапіро — Уїлка. Для визначення статистичних відмінностей між двома незалежними групами використовували непараметричний ранговий критерій Манна — Уїтні. Визначали відповідність розподілу генотипів у популяції рівновазі Харді — Вайнберга; порівняння частот алелей генів виконували з показником ступеня свободи 1 df, частот генотипів між групами і контролем зі ступенем свободи 2 df.

Результати та їх обговорення

Досліджено Pro12Ala поліморфізм гена PPAR-γ у 104 пацієнтів із НАЖХП і 45 практично здорових осіб (група контролю). Розподіл генотипів зазначеного поліморфізму гена PPAR-γ наведений у табл. 1. Серед обстежених пацієнтів Pro/Pro-генотип виявлено у 74 (71,2%), Pro/Ala — у 28 (26,9%), Ala/Ala — у 2 (1,9%) осіб.

Pro-алель гена PPAR-γ виявлено у 176 (84,6%) пацієнтів, Ala-алель — у 32 (15,4%) пацієнтів із 208 алелів. У групі практично здорових людей було 36 (80,0%) гомозиготних і 9 (20,0%) гетерозиготних носіїв Pro-алеля. Гомозиготних носіїв Ala-алеля серед практично здорових людей не було. Pro-алель гена PPAR-γ виявлено у 81 (90,0%), Ala — у 9 (10,0%) осіб із 90 алелів відповідно. Із представлених результатів видно, що розподіл генотипів та алелів вірогідно не розрізнявся у групах порівняння.

Показники біохімічного аналізу крові пацієнтів із НАЖХП залежно від Pro12Ala поліморфізму гена PPAR-γ наведено в табл. 2. У зв’язку з тим, що кількість носіїв Ala/Ala-генотипу була обмежена (n=2), вважали за необхідне аналізувати показники за наявністю мінорного Ala-алеля. Аналіз можливих відмінностей досліджуваних показників у практично здорових носіїв різних алельних варіантів Pro12Ala поліморфізму гена PPAR-γ не виявив статистично достовірних відмінностей, тому за контрольні показники приймали середні значення досліджуваних параметрів, отримані в усіх обстежених практично здорових людей.

Активність аспартатамінотрансферази (АсАТ) у пацієнтів із НАЖХП — носіїв Ala-алеля була достовірно вища на 33,6% (p=0,02) порівняно з такою у практично здорових осіб та на 29,1% (р=0,04) вища, ніж у пацієнтів із Pro/Pro-генотипом. Водночас активність аланінамінотрансферази (АлАТ) у пацієнтів із Ala-алелем була достовірно вища на 87,6% (p=0,002) порівняно з контрольними значеннями та на 45,2% (р=0,03), ніж у пацієнтів із Pro/Pro-генотипом гена PPAR-γ. Таке зростання активності АсАТ та АлАТ вказує на підвищення активності цитолітичних процесів у пацієнтів із НАЖХП — носіїв мінорного Аla-алеля.

Також у зазначеної когорти хворих — носіїв Ala-алеля — спостерігали тенденцію до вищої активності γ-глутамілтранспептидази та лактатдегідрогенази у крові порівняно з такими у носіїв Pro/Pro-генотипу. За рештою біохімічних показників крові відмінностей між пацієнтами із НАЖХП із різними генотипу не спостерігали.

Аналіз імовірних зв’язків цитокінів та адипокінів від поліморфних варіантів гена PPAR-γ (Pro12Ala) показав достовірно вищий на 45,6% (p=0,04) рівень лептину у пацієнтів із НАЖХП — носіїв Pro/Ala- та Ala/Ala-генотипів порівняно з таким у хворих носіїв Pro/Pro-генотипу (табл. 3).

Таке зростання вмісту лептину у пацієнтів носіїв Pro/Ala- та Ala/Ala-генотипів гена PPAR-γ може бути пов’язано з тенденцією до підвищення концентрації TNF-α, який здатний стимулювати вироблення лептину, у хворих цієї групи та, ймовірно, свідчить про формування у них синдрому лептинорезистентності (Altirriba J. et al., 2015; Paniagua J.A., 2016). Також у пацієнтів із Ala-алелем реєстрували у 2,43 раза (p=0,009) більший вміст proANP у крові, ніж у хворих із Pro/Pro-генотипом. Таке підвищення рівня proANP, яке асоціювалося з вищою активністю АсАТ, може свідчити про розвиток серцево-судинних ушкоджень, що характерно для пацієнтів із НАЖХП, та формування у них субклінічних стадій серцево-судинної недостатності (Bartkowiak R. et al., 2010; Motamed N. et al., 2016). За іншими показниками цитокінового та адипокінового профілів відмінностей між носіями різних поліморфних варіантів гена PPAR-γ (Pro12Ala) не виявлено.

У обстежених пацієнтів із НАЖХП незалежно від алельного варіанта гена PPAR-γ (Pro12Ala) спостерігали більші вертикальні розміри правої та лівої часток печінки порівняно з відповідними параметрами у практично здорових осіб. При розрахунку можливого зв’язку показників ультрасонографічного дослідження розмірів печінки залежно від Pro12Ala поліморфізму гена PPAR-γ достовірних відмінностей не виявили (табл. 4).

Висновки

Досліджений Pro/Ala поліморфізм гена PPAR-γ не впливає на ризик розвитку НАЖХП. Наявність в гетеро- або гомозиготному стані Ala-генотипу гена PPAR-γ у пацієнтів із НАЖХП асоційована з достовірно вищою активністю маркерів цитолітичного синдрому на тлі подібних структурно-функціональних змін печінки. У обстежених нами пацієнтів — носіїв Ala-алелю — відзначено також вищі рівні лептину та proANP у крові.

Перспективу подальших досліджень вбачаємо у поглибленні досліджень зв’язку поліморфізму гена PPAR-γ з розвитком та прогресуванням НАЖХП та інших хронічних дифузних захворювань печінки, а також застосуванні результатів цих досліджень для оптимізації терапевтичних схем лікування зазначеного контингенту хворих.

Список використаної літератури

• Бабак О.Я., Колеснікова О.В., Шуть І.В. (2011) Вплив сироваткового рівня адипонектину на вираженість неалкогольного стеатозу печінки у хворих на цукровий діабет 2-го типу з надлишковою масою тіла. Сучасна гастроентерологія, 1(57): 5–11.
• МОЗ України (2014) Наказ МОЗ України від 06.11.2014 р. № 826 «Про затвердження та впровадження медико-технологічних документів зі стандартизації медичної допомоги при хронічних неінфекційних гепатитах» (http://www.moz.gov.ua/ua/portal/dn_20141106_0826.html).
• Харченко Н.В., Анохіна Г.А., Харченко В.В. та ін. (2011) Особливості лікування неалкогольного стеатогепатиту у хворих на цукровий діабет. Сучасна гастроентерологія, 2(58): 60–64.
• Altirriba J., Poher A.L., Rohner-Jeanrenaud F. (2015) Chronic oxytocin administration as a treatment against impaired leptin signaling or leptin resistance in obesity. Front. Endocrinol. (Lausanne), 6: 119.
• Bartkowiak R., Wozakowska-Kapłon B., Janiszewska G. (2010) Plasma NT-proANP in patients with persistent atrial fibrillation who underwent successful cardioversion. Kardiol. Pol., 68(1): 48–54.
• Bellentani S., Scaglioni F., Marino M., Bedogni G. (2010) Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease. Dig. Dis., 28(1): 155–161.
• Boitier E., Gautier J.C., Roberts R. (2003) Advances in understanding the regulation of apoptosis and mitosis by peroxisome-proliferator activated receptors in pre-clinical models: relevance for human health and disease. Comp. Hepatol., 2(1): 3.
• Browning J.D., Szczepaniak L.S., Dobbins R. et al. (2004) Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: impact of ethnicity. Hepatology, 40(6): 1387–1395.
• Canbay E., Kurnaz O., Canbay B. et al. (2012) PPAR-gamma Pro12Ala polymorphism and gastric cancer risk in a Turkish population. Asian Pac. J. Cancer Prev., 13(11): 5875–5878.
• Cao C.Y., Li Y.Y., Zhou Y.J. et al. (2012) The C-681G polymorphism of the PPAR-γ gene is associated with susceptibility to non-alcoholic fatty liver disease. Tohoku J. Exp. Med., 227(4): 253–262.
• Conlon B.A., Beasley J.M., Aebersold K. (2011) Nutritional management of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Nutrients, 5: 4093–4114.
• European Association for the Study of the Liver (EASL), European Association for the Study of Diabetes (EASD), European Association for the Study of Obesity (EASO) (2016) EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the management of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol., 64(6): 1388–1402.
• Motamed N., Rabiee B., Poustchi H. et al. (2016) Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and 10-year risk of cardiovascular diseases. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol., 16: 30104–30108.
• Osterreicher C.H., Brenner D.A. (2007) The genetics of nonalcoholic fatty liver disease. Ann. Hepatol., 6(2): 83–88.
• Paniagua J.A. (2016) Nutrition, insulin resistance and dysfunctional adipose tissue determine the different components of metabolic syndrome. World J. Diabet., 19: 483–514.
• Ratziu V., Bellentani S., Cortez-Pinto H. et al. (2010) A position state-ment on NAFLD/NASH based on the EASL 2009 special conference. J. Hepatol., 53: 372–384.
• Semple R.K., Chatterjee V.K., O’Rahilly S. (2006) PPAR gamma and human metabolic disease. J. Clin. Invest., 116(3): 581–589.
• Wilfred de Alwis N.M., Day C.P. (2007) Genetics of alcoholic liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Semin. Liver Dis., 27(1): 44–54.
• Williams R., Aspinall R., Bellis M. et al. (2014) Addressing liver disease in the UK: a blueprint for attaining excellence in health care and reducing premature mortality from lifestyle issues of excess consumption of alcohol, obesity, and viral hepatitis. Lancet, 384(9958): 1953–1997.
• Hui Y., Yu-Yuan L., Yu-Qiang N. et al. (2008) Effect of peroxisome proliferator-activated receptors-gamma and co-activator-1alpha genetic polymorphisms on plasma adiponectin levels and susceptibility of non-alcoholic fatty liver disease in Chinese people. Liver Int., 28(3): 385–392.
• Zhou Y.J., Li Y.Y., Nie Y.Q. et al. (2010) Influence of polygenetic polymorphisms on the susceptibility to non-alcoholic fatty liver disease of Chinese people. J. Gastroenterol. Hepatol., 25(4): 772–777.

Адреса для листування:
Горовенко Наталія Григорівна
04112, Київ, вул. Дорогожицька, 9
Національна медична академія
післядипломної освіти імені П.Л. Шупика,
кафедра медичної та лабораторної генетики
E-mail: [email protected]

Одержано 13.04.2017