Характеристика деяких біологічних властивостей кампілобактерій різного походження та їх вплив на епідемічний процес кампілобактеріозу

Вступ

В останні роки встановлено, що серед гострих кишкових інфекцій невизначеної етіології суттєве місце належить кампілобактеріозу, етіологічним агентом якого є бактерії роду Campylobacter. На сьогодні ця кишкова інфекція зареєстрована у багатьох країнах світу на всіх континентах (Чайка Н.А. и соавт., 1988). До початку 90-х років ХХ ст. у глобальній системі картування кампілобактеріозу Україна була білою плямою (Кирик Д.Л. и соавт., 1991; Kyryk D., 2010).

Розвиток епідемічного процесу при кампілобактеріозній інфекції неможливо пізнати без вивчення факторів патогенності кампілобактерій, а також вірулентності циркулюючих штамів. Патогенні властивості кампілобактерій досліджені недостатньо, мають фрагментарний характер, їх результати суперечливі. Особливо це стосується оцінки вірулентності штамів (Mawer S.L., 1988).

Мета роботи — вивчення деяких факторів патогенності й вірулентності кампілобактерій, виділених із різних джерел, та їх впливу на регіональні особливості епідемічного процесу.

Об’єкт і методи дослідження

Цитопатогенну дію (ЦПД) 196 штамів кампілобактерій різного походження вивчено у системі in vitro на клітковій культурі HEр-2 (Lindblom G.B. et al., 1990). За рівнем цитопатогенності, вираженим у ЦПД50 за Кербером, кампілобактерії поділено на високоцитопатогенні — із ЦПД50 у ме­жах 0,1⋅10⁸–1,0⋅10⁹; цитопатогенні — 0,1⋅10¹⁰–1,0⋅10¹¹ та ацитопатогенні — ≥0,1⋅10¹².

У роботі для вивчення адгезивності та інвазивності кампілобактерій використано 90 штамів різного походження: клінічні ізоляти, «курячі» штами та штами із об’єктів довкілля (по 30 штамів кожної групи). Клітинні культури HEр-2 заражали шляхом поміщення покривного скла із вирощеним моношаром у пробірки із концентрацією мікроорганізмів 107 клітинно-утворюючих одиниць (КУО)/мл. Результати дослідів враховували після інкубації при 37 °С протягом 0,5; 1,0; 6,0 та 24 год. Через зазначені проміжки часу інкубації флакони із зараженими моношарами промивали стерильним фізіологічним розчином та заливали підтримувальним середо­вищем Ігла для подальшої експозиції при 37 °С. На кожному етапі препарати фіксували протягом 30 хв 96% розчином етилового спирту. Зафіксовані моношари фарбували гематоксиліном протягом 5 хв, дофарбовували 1% водним розчином еозину, промивали дистильованою водою, просвітлювали у ксилолі, висушували та поміщали у бальзам на предметні скельця.

Адгезивні властивості оцінювали за індексом адгезивності (середня кількість мікробних клітин, що прикріпилися до 1 клітини, із числа клітин, що брали участь в адгезії), інвазивні — за індексом інвазивності (кількість інвазованих всередину бактерій на 1 клітину HEр-2).

Вивчення хромосомно-плазмідного детермінування антибіотикорезистентності у 38 штамів кампілобактерій різного походження проведено загальновживаним методом Кадо (Маниатис Ф. и соавт., 1984). Для детекції низькокопійних плазмід при електрофоретичному аналізі використано надлишкову кількість плазмідної ДНК. Електрофорез ДНК у 0,7% агарозному гелі здійснено у горизонтальному слеб-апараті у трисборатному буфері при напруженні електричного поля 150 В протягом 5 год. Після електрофорезу пластинку гелю обробляли розчином бромистого етидію (0,5 мкг/мл) протягом 30 хв і розглядали в ультрафіолетових променях. Забарвлену пластинку гелю фотографували. Як маркери молекулярної маси використано ДНК фага λ розміром близько 36⋅10⁶ та його фрагменти, отримані рестрикцією ендонуклеазою Hind ІІІ, і мали розміри — 15,3⋅10⁶; 6,2⋅10⁶; 4,3⋅10⁶; 2,9⋅10⁶; 1,5⋅10⁶; 1,3⋅10⁶. Величину плазмідної ДНК визначено шляхом порівняння швидкості міграції плазмід досліджених штамів і стандартних плазмід, а також співвідношенням швидкості руху у гелі фрагментів дослідженої плазмідної ДНК, обробленої рестриктазами, і швидкості міграції ДНК фага λ, оброб­леної таким же чином. На основі вимірювання фрагментів ДНК фага λ побудовано калібровочні криві і вирахувано молекулярну масу фрагментів досліджених плазмід та повну масу ДНК плазмід штамів кампілобактерій. Для доказу плазмідної природи антибіотикорезистентності штами кампілобактерій, що містили плазміди, оброблено 0,1%; 0,3%; 0,5% розчином бромистого етидію. З пробірок із напіврідким м’ясо-пептонно-печінковим агаром із найбільшою кількістю бромистого етидію, де був ріст кампілобактерій, матеріал висівали на селективне щільне поживне середовище для отримання окремих колоній. Після 48 год інкубації при температурі 42 °С у мікроаерофільних умовах відібрано і перевірено на втрату плазмід 100 клонів, що втратили антибіотикорезистентність.

Вивчення вірулентності проводили на 120 штамах кампілобактерій, виділених від хворих дітей, дорослих, курей та об’єктів довкілля (по 30 штамів з кожної групи). Показник вірулентності (LD50 за Кербером) визначали шляхом внутрішньочеревного зараження 456 безпородних білих мишей масою тіла 16–20 г, хоріоналантоїсного зараження 380 курячих ембріонів (Mahajan S., Rodgers F.G., 1989) та інтрагастрального (через зонд) зараження 360 7-денних курчат (Beery J.T. et al., 1988).

Результати та їх обговорення

Розвиток епідемічного процесу при кампілобактеріозній інфекції неможливо визначити без вивчення факторів патогенності кампілобактерій, а також вірулентності циркулюючих штамів.

Адгезивно-інвазивні властивості патогенних бактерій є необхідною передумовою прояву їх вірулентної здатності та початку розвитку інфекційного процесу. Нами вперше визначено індекси адгезивності та інвазивності in vitro на культурі клітин HEр-2-циркулюючих в Україні штамів кампілобактерій різного походження. На початку спостереження індекс адгезивності становив для клінічних ізолятів — 10,6, «курячих» штамів — 7,1 і штамів довкілля — 5,5; індекс інвазивності — 5,1; 3,6 і 2,9 відповідно. Через добу спостереження ці показники були: індекс адгезивності для клінічних ізолятів — 25,2; «курячих» штамів — 20,5 і штамів довкілля — 16,8; індекс інвазивності — 16,0; 11,2 і 12,1 відповідно (табл. 1). Відсутність вірогідної різниці (р>0,05) цих показників у штамів різного походження свідчить про однакову наявність ризику інфікування людей при широкій циркуляції кампілобактерій серед курей і об’єктів довкілля та необхідності посилення гігієнічних заходів, направлених на обмеження циркуляції цих збудників. Раніше адгезивно-інвазивні властивості лише клінічних ізолятів вивчали M.E. Konkel, L.A. Joens (1989).

Таблиця 1. Середні показники ураження культури клітин НЕр-2 після зараження штамами кампілобактерій різного походження (M±m)

Однією з кардинальних особливостей, що визначає можливість інфекційного процесу, є здатність збудника прикріплятися до клітини-хазяїна, проникати всередину та викликати ЦПД. ЦПД клінічних ізолятів кампілобактерій на культурах INT 407 та CHO клітин доведено Р. Kuusela та спів­авторами (1989). Нами вперше встановлено ЦПД на культури клітин HEр-2 кампілобактерій різних видів і різного походження, поділено їх за ступенем цитопатогенності (ЦПД50) на три групи, що дало змогу оцінити їх епідемічну небезпеку. Встановлено, що 84,7% штамів кампілобактерій, виділених із різних джерел, мали ЦПД. Високоцитопатогенними були 31,6% вивчених штамів, цитопатогенними — 53,1%, ацитопатогенними — 15,3%. Найбільша кількість високоцитопатогенних штамів була серед клінічних ізолятів — 52,6%. Серед сільськогосподарських тварин і птиці кількість високоцитопатогенних штамів розподілена таким чином: кури — 44,1%; телята — 30,0%; свині — 29,4%. Високоцитопатогенні штами кампілобактерій зі стічних вод і води відкритих водойм виявлено у 16,7 і 10,0% досліджених проб відповідно (табл. 2). Нами не встановлено вірогідної різниці у кількості цитопатогенних штамів різного походження (р>0,05). Це підтверджує, що цитопатогенність є біологічною особливістю бактерій роду Campylobacter, не залежно від джерела їх виділення.

Таблиця 2. Розподіл штамів кампілобактерій за ступенем цитопатогенної активності (ЦПД50)

Також показано кореляцію між рівнем цитопатогенної активності кампілобактерій і тяжкістю клінічних проявів кампілобактеріозу. Середні показники рівня ЦПД клінічних ізолятів у хворих на кампілобактеріоз тяжкої, середньої тяжкості та легкої форми становили 0,1⋅10¹⁰; 0,4⋅10¹⁰ та 1,0⋅10¹⁰ (р≤0,05) відповідно. Доказом деструктивних змін в кишечнику була наявність крові та слизу у випорожненнях 55,0% хворих (що свідчить про певну патогномонічність гемоколіту), а також запальних змін і  набряку його слизової оболонки. Раніше А.В. Гореловим та співавторами (2000) установлено кореляцію між рівнем адгезивної активності штамів кампілобактерій виду Campylobacter jejuni (C. jejuni) та тяжкістю клінічного перебігу інфекції у дітей. Виявлена нами певна кількість ацитопатогенних штамів (15,3%) свідчить про те, що цитопатогенність не є єдиною детермінантою патогенності цих збудників.

Необхідно відзначити, що процеси зниження цитопатогенної активності кампілобактерій та формування антибіотикорезистентних штамів є паралельними і взаємопов’ язаними. За даними аналізу цитопатогенної активності плазмідомістких штамів та їх безплазмідних клонів встановлено вірогідне (р<0,01) підвищення цього показника із втратою штамами плазмід: ЦПД50 становив у клінічних штамів 0,3±0,06⋅10⁸ — 0,8±0,01⋅10⁸, «курячого» штаму — 0,2±0,08⋅10¹⁰, штаму із об’єктів довкілля — 0,7±0,3⋅10¹⁰. При цьому ЦПД50 їх безплазмідних клонів були — 0,4±0,05⋅10⁵ — 0,1±0,03⋅10⁶; 0,5±0,1⋅10⁷ та 0,2±0,05⋅10⁸ відповідно (табл. 3). Такі штами поряд із ростом їх антибіотикорезистентності, мають селективну перевагу при циркуляції в різних екологічних нішах, тому що їх життє­здатність підвищується в умовах широкого застосування антибіотиків в закладах охорони здоров’я та у ветеринарії. При цьому збільшується кількість інапарантних форм та носійства, а також ускладнюється діагностика і санація джерел інфекції. Аналогічну закономірність на прикладі зниження вірулентності та формування множинної антибіотикорезистентності щодо сальмонел доведено раніше (Зарицкий А.М., 1988).

Таблиця 3. Характеристика штамів кампілобактерій та їх безплазмідних клонів за рівнем ЦПД (ЦПД50)

*Gm — гентаміцин; Kb — карбеніцилін; Km — канаміцин; Tc — тетрациклін; Er — еритроміцин.

Для оцінки епідемічної небезпеки циркулюючих штамів визначено їх вірулентність in vivo на лабораторних моделях. Установлено, що LD50 для білих мишей становив у штамів, виділених від хворих на кампілобактеріоз дітей та із об’єктів довкілля — 2,7⋅10¹⁰ та 4,3⋅10¹¹ КУО відповідно. Зроблено висновок, що внутрішньопорожнинне зараження безпородних білих мишей не може бути використане для визначення вірулентності кампілобактерій внаслідок малої чутливості цієї моделі до зазначених патогенів. Установлено, що у курячих ембріонів можна викликати кампілобактеріозну інфекцію, загибель від якої відзначено при зараженні дозами кампілобактерій, на 2–3 порядки нижчими, ніж у білих мишей, що свідчить про більшу чутливість курячих ембріонів до цих збудників. При цьому LD50 штамів кампілобактерій, виділених від хворих дітей, дорослих, курей та об’єктів довкілля, були 2,0⋅10⁸; 5,3⋅10⁹; 6,3⋅10⁹ та 2,1⋅10¹⁰ КУО відповідно. У дослідах хоріоналантоїсного зараження кампілобактеріями курячих ембріонів, а також натурних спостереженнях за перебігом кампілобактеріозу у 7-денних курчат, зареєстровано гепатотропну дію C. jejuni і C. coli із розвитком гострого продуктивного і серозно-ексудативного гепатиту.

Отримані величини LD50 (10⁸–10¹¹) кампілобактерій різного походження свідчать про низьку вірулентність циркулюючих в Україні штамів. Водночас проведеними S. Mahajan, F.G. Rodgers (1989) дослідженнями встановлено високу вірулентність клінічного штаму C. jejuni для курячих ембріонів: LD50 — 10²–10⁴. Це підтверджує положення про штамову детермінацію цього показника.

Таким чином, у кампілобактерій, як і в інших мікроорганізмів, патогенність є полідетермінантною ознакою, що визначається сукупністю факторів. До оцінки патогенних можливостей цих збудників необхідно підходити комплексно, враховуючи можливість синтезу ендотоксину, цитотоксину, ентеротоксину, а також ферментів патогенності. У зв’язку з цим основ­ними тенденціями розвитку досліджень у цьому напрямку є комплексний підхід до оцінки значимості вже вивчених та пошук нових факторів патогенності, а також умов їх прояву.

Висновки

1. Установлено, що біологічними особ­ливостями бактерій роду Campylobacter, незалежно від джерел їх виділення, є цитопатогенність та адгезивно-інвазивні властивості. За рівнем цитопатогенності штами кампілобактерій поділяють на групи. Отримані величини LD50 (10⁸–10¹¹) штамів кампілобактерій, що циркулюють в Україні, визначають низький ступінь їх вірулентності, що зумовлює наявність «прихованого» епідемічного процесу.

2. Процеси формування множинної антибіотикорезистентності штамів кампілобактерій та зниження їх вірулентності паралельні та взаємопов’язані. Такі штами мають селективну перевагу при циркуляції у різних екологічних нішах.

3. Боротьба з кампілобактеріозною інфекцією передбачає комплексний підхід і потребує не лише організації санітарно-гігієнічних і ветеринарних заходів, але й екологічних. Комплексний епідеміологічний нагляд за кампілобактеріозом в сучасних умовах має враховувати потенційну мінливість збудника, наявність популяції із низькою вірулентністю та високою адаптаційною здатністю.

Література

• Горелов А.В., Горская Е.М., Жуховицкий В.Г., Бондаренко В.М. (2000) Адгезия клинических изолятов Campylobacter jejuni к эпителиальным клеткам кишечника in vitro. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 6: 3–6.
• Зарицкий А.М. (1988) Сальмонеллезы. Здоров’я, Київ, 160 с.
• Кирик Д.Л., Шабловская Е.А., Кролевецкая Н.М. (1991) Современные аспекты эпидемиологии кампилобактериоза. В сб.: А.М. Зарицкий (ред.) Кишечные инфекции. Киев, вып. 22: 62–70.
• Маниатис Ф., Фриг Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 334 с.
• Чайка Н.А., Хазенсон Л.Б., Бутцлер Ж.П. (1988) Кампилобактериоз. Медицина, Ленинград, 352 с.
• Beery J.T., Hugdahl M.B., Doyle M.P. (1988) Colonization of gastrointestinal tracts of chicks by Campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., 54(10): 2365–2370.
• Konkel M.E., Joens L.A. (1989) Adhesion to and invasion of HEp-2 cells by Campylobacter spp. Infect. Immun., 57(10): 2984–2990.
• Kuusela P., Moran A.P., Vartio T., Kosunen T.U. (1989) Interaction of Campylobacter jejuni with extracellular matrix components. Biochim. Biophys. Acta., 993(2–3): 297–300.
• Kyryk D. (2010) Epidemic Process of Campylobacteriosis on the Territory of Ukraine. 28-th Аnnual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases, Nice, France, May 4–8, 2010, р. 129.
• Lindblom G.B., Cervantes L.E., Sjögren E. et al. (1990) Adherence, enterotoxigenicity, invasiveness and serogroups in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains from adult humans with acute enterocolitis. APMIS, 98(2): 179–184.
• Mahajan S., Rodgers F.G. (1989) Virulence of Campylobacter jejuni for chicken embryos. J. Clin. Microbiol., 27(6): 1377–1379.
• Mawer S.L. (1988) The pathogenicity of environmental campylobacters — a human volunteer experiment. Epidemiol. Infect., 101(2): 295–300.

Адреса для листування:
Кирик Дмитро Леонідович
04112, Київ, вул. Дорогожицька, 9
Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, кафедра мікробіології і епідеміології